茄子SmWRKY65基因克隆及其对青枯病的抗性分析.pdf

收稿日期 2020 12 24 基金项目 国家重点研发计划项目 2017YFD0101904 作者简介 刘开 1994 女 在读硕士生 研究方向为蔬菜遗传育种与生物技术 E mail 1603591859 通信作者 曹必好 1970 男 博士 教授 研究方向为蔬菜遗传育种与生物技术 E mail caobh01 广东农业科学 2021 48 3 42 52 Guangdong Agricultural Sciences DOI 10 16768 j issn 1004 874X 2021 03 006 刘开 余炳伟 李丹丹 陈娜 曹必好 冷茄子 SmWRKY65 基因克隆及其对青枯病的抗性分析 J 广东农业科学 2021 48 3 42 52 茄子 SmWRKY65 基因克隆及其对青枯病的抗性分析 刘 开 1 余 炳 伟 1 李 丹 丹 2 陈 娜 1 曹 必 好 1 1 华南农业大学园艺学院 广东 广州 510642 2 华南农业大学农学院 广东 广州 510642 摘 要 目的 通过克隆 SmWRKY65 Solanum melongena L WRKY65 基因并分析其生物信息学与功能 以期探究 SmWRKY65 对茄子青枯病的响应情况 方法 以茄子抗病植株 E 31 为试验材料 叶片 cDNA 为模板 通过 PCR 技术获得 SmWRKY65 基因 并利用 ExPASy ProtParam tool 对其进行生物信息学分析 运用实时荧光 定量 PCR quantitative real time PCR qRT PCR 的方法对其不同组织部位与抗病 感病材料 E 32 中的响 应情况进行分析 通过双酶切法构建亚细胞定位载体 运用病毒诱导的基因沉默 virus induced gene silencing VIGS 技术构建 pTRV2 SmWRKY65 载体并侵染茄子抗病植株 结果 在茄子中成功克隆了 SmWRKY65 基 因 该基因开放阅读框为 834 个核苷酸序列 编码 277 个氨基酸残基 在 71 131 区域具有 1 个含 60 个氨基酸 的 WRKY 保守域 定位于细胞核中 时空表达分析发现 SmWRKY65 在茄子根组织中的表达量最高 叶中次 之 茎中最低 qRT PCR 分析表明 SmWRKY65 在茄子抗病和感病材料中均响应青枯病菌的诱导上调表达 VIGS 结果表明 与清水和 pTRV2 空载对照相比 接种青枯病菌后 pTRV2 SmWRKY65 沉默植株的叶片表现出 明显的萎蔫症状 结合 qRT PCR 分析发现 pTRV2 SmWRKY65 表达量较对照组明显下降 结论 SmWRKY65 在茄子抗病材料中的表达水平明显高于感病材料 且 pTRV2 SmWRKY65 植株与对照相比表现为易感症状 说明 SmWRKY65 沉默后茄子抗青枯病的能力下降 表明 SmWRKY65 可能涉及茄子青枯病抗性相关过程的调控 关键词 茄子 青枯病 WRKY 转录因子 实时荧光定量 PCR VIGS 中图分类号 S641 1 文献标志码 A 文章编号 1004 874X 2021 03 0042 11 Cloning of SmWRKY65 Gene and Its Resistance to Bacterial Wilt in Eggplant LIU Kai 1 YU Bingwei 1 LI Dandan 2 CHEN Na 1 CAO Bihao 1 1 College of Horticulture South China Agricultural University Guangzhou 510642 China 2 College of Agriculture South China Agricultural University Guangzhou 510642 China Abstract Objective The response of SmWRKY65 Solanum melongena L WRKY65 to bacterial wilt of eggplant was explored by cloning SmWRKY65 gene and analyzing its bio information and function Method The eggplant disease resistant plants E 31 and cDNA from its leaves were used as tested materials and template respectively The SmWRKY65 was obtained by PCR technology and bioinformatics analysis was constructed by ExPASy ProtParam tool The expression analysis of different tissue sites and disease resistant and susceptible materials E 32 was performed by quantitative real time PCR qRT PCR method Subcellular localization vector was constructed by double digestion method The pTRV2 SmWRKY65 vector was constructed by virus induced gene silencing VIGS technology and the 43 研究意义 茄子 Solanum melongena L 是茄科茄属常见的蔬菜作物 起源于东南亚的热 带地区 在我国南北各地广泛栽培 其根 茎 叶皆可入药 果实中富含蛋白质 脂肪 维生素 龙葵碱和多种微量元素 既可用作蔬食 又具有 降血压 防治胃癌等功效 1 营养价值与药用价 值极高 青枯病是茄子栽培中常见的细菌性土传 病害之一 其致病因子是青枯雷尔氏菌 Ralstonia solanacearum 主要从根部侵入寄主植物的维 管束部位并迅速扩散到地上部组织 对植株可造 成毁灭性的破坏 2 土温 20 左右时为茄子青 枯病的发病高峰期 微酸性土壤 连作以及气温 急剧上升等都会导致青枯病严重发生 3 我国茄 子青枯病发生较为普遍 发病时严重影响茄子的 产量和品质 导致茄子大面积减产减收 3 但茄 子抗青枯病的分子机理十分复杂 涉及多种因子 调控 迄今仍未研究清楚 因此 深入开展茄子 抗青枯病的相关研究显得尤为重要 前人研究进展 植物 WRKY 转录因子是一 种具有多功能调控作用的转录因子 最早是从甘 薯 Dioscorea esculenta Lour Burkill 的 SPF1 基因中被鉴定出来的 因参与调控甘薯中的糖信 号转导过程而备受关注 4 之后 陆续从野燕麦 Avena fatua L 欧 芹 Petroselinum crispum Mill Hill 和 水 稻 Oryza sativa L 的基因 中成功鉴定出相应的 WRKY 基因 并详细阐明了 其在植物生长发育 信号转导及其抗逆过程中发 挥的重要作用 5 7 近年来 关于 WRKY 转录 因子响应生物胁迫及非生物胁迫相关过程的研究 多有报道 8 研究发现 小麦 TaWRKY2 和陆地 棉 GhWRKY33 基因是响应干旱调节的关键基因 过表达 TaWRKY2 和 GhWRKY33 基因能够分别增 强小麦和转基因拟南芥植株的抗旱性 9 10 决登 伟等 11 发现 玉米 ZmWRKY25 like 基因在响应 盐胁迫和低温胁迫中上调表达 Sun 等 12 认为 山葡萄 VaWRKY33 基因在低温胁迫下诱导表达以 增强植株的耐寒性 进一步研究发现 WRKY 转 录因子在调控植物抗病性方面起关键作用 周茜 茜等 13 研究发现 苹果 MdWRKY40 基因通过介 导水杨酸 Salicylic acid SA 信号途径正向调 控苹果对轮纹病菌的抗性 龙琴等 14 认为 过 表达 CsWRKY61 能够激活与生物胁迫和信号转导 相关的途径 增强柑橘对溃疡病的抗性 殷丽华 等 15 研究发现 小豆 VaWRKY33 基因能够响应 豇豆单胞锈菌的诱导上调表达 并明显提高小豆 锈病的抗性 在拟南芥抗病性研究中发现 拟南 芥 AtWRKY61 和 AtWRKY70 基因分别正向调控芜 菁皱叶病毒和丁香假单胞菌的抗性 16 17 王丹 等 18 研究发现 VqWRKY53 通过促进 SA 和芪 类物质的合成 可增强中国野生毛葡萄植株的抗 病性 本研究切入点 目前已有研究在茄属植物 欧白英 Solanum dulcamara 的基因组中克隆得 到 WRKY 基因 并对其相应的生物信息学功能进 行了分析 19 但与茄子青枯病抗性相关的研究 仍鲜见报道 拟解决的关键问题 本研究通过 克隆与茄子青枯病抗性相关的 SmWRKY65 基因 对其进行生物信息学 亚细胞定位及时空表达模 disease resistant eggplant plants were infected Result The SmWRKY65 gene was successfully cloned in eggplant The gene contains 834 bp nucleotide sequences codes 277 amino acid residues in its open reading frame and concludes a WRKY conserved domain containing 60 amino acid in the regions of 71 131 The analysis of subcellular localization showed that SmWRKY65 GFP fusion protein was found in the cell nucleus The expression analysis of different tissues revealed that SmWRKY65 had highest expression in eggplant roots followed by leaves and stems The qRT PCR analysis testified that SmWRKY65 was up regulated in response to the induction of bacterial wilt in eggplant resistant and susceptible plants The VIGS results showed that the leaves of pTRV2 SmWRKY65 silent plants was observed clear wilting symptoms when compared with water and pTRV2 control vector By qRT PCR profiling it was observed that pTRV2 SmWRKY65 expression was obviously decreased when compared with control groups Conclusion The expression level in disease resistant eggplant materials was significantly higher than that in susceptible materials and the pTRV2 SmWRKY65 plants showed more symptoms of susceptibility when compared with control groups indicating that the silence of SmWRKY65 reduced the resistance to bacterial wilt of eggplants and SmWRKY65 was possibly related to the process regulation of eggplant resistance to bacterial wilt Key words eggplant bacterial wilt WRKY transcription factor real time fluorescence quantitative PCR virus induced gene silencing VIGS 44 式分析 并以清水和 pTRV2 空载为对照 构建 pTRV2 SmWRKY65 载体 探究SmWRKY65 在茄 子抗病植株 E 31 中沉默后对茄子青枯病的响 应情况 以期为茄子青枯病抗病机理的相关研究 提供理论基础 为茄子青枯病抗性品种的选育提 供参考 1 材料与方法 1 1 试验材料 茄子抗病材料 S melongena L E 31 R 和感病材料 S melongena L E 32 S 由 曹 必 好教授提供 青枯菌致病菌株从感病材料中分离 得到 VIGS 载体构建所需的烟草脆裂病毒载体 pTRV 1 和 pTRV 2 由华南地区园艺作物生物学与 种质创制重点实验室保存 DH5 大肠杆菌转化 菌株和 GV3101 转农杆菌菌株均购自生工生物科 技有限公司 RNA 提取试剂盒 Trizol 购自北京华越洋生物 科技有限公司 PCR 反应试剂盒 2 HiFiTaq PCR StarMix 快速 DNA 胶回收试剂盒 StarPrep 和快速 质粒小提试剂盒 StarPrep 均为 GenStar 产品 反 转录试剂盒 HiScript Q Select RT SuperMix for qPCR 和实时荧光定量 PCR 试剂盒 a SYBR Premix Ex Taq kit 购自南京诺唯赞生物科技有限公司 1 2 试验方法 1 2 1 茄子不同组织部位总R N A的提取与 cDNA 的合成 在茄子幼苗三叶期时分别采集茄 子根 茎 叶部位的样品 用锡箔纸包裹并迅 速放入液氮中 每个样品 3 次重复并做好标记 之后采用 Trizol 试剂盒的方法分别提取茄子根 茎 叶的 RNA 并采用 HiScript Q Select RT SuperMix for qPCR 试 剂 盒 进 行 逆 转 录 反 应 合 成 cDNA 详细步骤参照说明书 cDNA 合成 PCR 反 应体系 10 L 反应程序为 25 10 min 50 30 min 85 5 min 1 2 2 SmWRKY65 序列的获得与基因克隆 本 课题组前期通过转录组测序得到 WRKY65 基因 序 列 登 录 号 Sme2 5 00423 1 g00013 1 利 用 Primer 5 0 软 件 设 计 引 物 SmWRKY65 F SmWRKY65 R 表 1 以茄子叶片 cDNA 为模 板通过 PCR 10 L 体系 扩增得到 SmWRKY65 基因序列 PCR 反应程序 94 预变性 2 min 94 变性 30 s 55 退火 30 s 72 延伸 50 s 32 个循环 72 延伸 5 min 采用 1 琼脂糖凝 胶电泳检测 PCR 产物的特异性 将条带明亮 大 小与预期一致的条带采用 StarPrep 快速 DNA 胶回 收试剂盒进行纯化 1 2 3 SmWRKY65 的生物信息分析 利用 ExPASy ProtParam tool http www expasy org tools protparam html 对 SmWRKY65 蛋白理化性质进 行 分 析 使 用 ProtScale http ca expasy org tools protscale html 和 SOPM 工 具 https npsa prabi ibcp fr cgibin npsa automat pl page np sa sopma html 分 别 预 测 SmWRKY65 蛋 白 亲 疏 水 性 和 二 级 结 构 类 型 使 用 NCBI CD Search https www ncbi nlm nih gov Struc ture cdd wrpsb cgi 和 PredictProtein 工具 http www predictprotein org 对 SmWRKY65 蛋白序列进行二级结构的结构域 和结合位点预测 通过 NCBI Blast 在线比对工具 检索 SmWRKY65 同源性基因 将相似性较高的同 源性序列下载后 利用 MEGA 7 0 软件 UPGMA 法 构建进化树 1 2 4 PCR 产物的连接与 SmWRKY65 质粒的提 取 将 上 述 1 2 2 中 的 PCR 产 物 连 接 pMD 19 T 载体 pMD 19 T 载体 Solution I 回收产物 0 5 L 4 5 L 5 L 之后转化大肠杆菌感受态 DH5 用 pMD19 T 通用引物检测阳性菌落 委 托广州擎科生物技术有限公司进行测序 确定重 组子 挑取重组子进行扩摇 采用 StarPrep 快速 质粒小提试剂盒提取 SmWRKY65 质粒 具体步 骤参照说明书 1 2 5 SmWRKY65 的时空表达模式分析 利用 Primer 5 0 软 件 设 计 SmWRKY65 荧光定量引物 q SmWRKY65 F q SmWRKY65 R 表 1 以茄子内参 18S rRNA 18S rRNA F 18S rRNA R 表 1 为对照 采用 a SYBR Premix Ex Taq Kit 试 剂盒对茄子根 茎 叶组织进行 SmWRKY65 实 时荧光定量 qRT PCR 表达量的测定 详细 步骤参照说明书 再分别以茄子抗病和感病植 株为材料 在茄子苗 3 叶期接种青枯病菌以分析 SmWRKY65 在茄子抗病和感病植株中的表达情 况 并在接种后 0 3 6 9 h 4 个时间段分别采 集抗病 感病植株叶片 以茄子内参 18S rRNA 18S rRNA F 18S rRNA R 表 1 为对照 采 用 SmWRKY65 荧光定量引物 q SmWRKY65 F q SmWRKY65 R 表 1 进 行 qRT PCR 表 达 量 的测定 以分析 SmWRKY65 在抗病和感病材料中 的表达量差异 qRT PCR 程序为 95 预变性 2 min 95 变性 10 s 56 退火 20 s 72 延 45 伸 35 s 35 个循环 每个样品 3 次生物学重复 最后取平均值进行分析 基因的相对表达量应用 2 Ct 方法进行分析 20 1 2 6 构建亚细胞定位载体及转化洋葱 利用 Primer 5 0 软件设计 SmWRKY65 亚细胞定位引物 SmWRKY65 GFP EB F SmWRKY65 GFP EB R 表 1 通过 PCR 反应克隆 SmWRKY65 亚细胞定位目的片段 使用 EcoR I 和 BamH I 酶 对亚细胞定位载体 pC018 和目的片段进行双酶切 并连接成重组质粒 SmWRKY65 GFP 测序后将重 组质粒转入农杆菌 GV3101 转化洋葱内表皮组织 3 d 后在显微镜下观察亚细胞定位结果 1 2 7 VIGS 载体的构建 通过在线工具 vigs 寻找特异性的 VIGS 载体区域 根据 pTRV2 载体多克隆位点所包含的酶切位点 设 计 1 对 特 异 性 引 物 pTRV2 WRKY65 F pTRV2 WRKY65 R 表 1 以茄子叶片 cDNA 为模板进行 PCR 反应获得长度为 250 bp 左右的 特异性 PCR 产物 用双酶切 EcoR I 和 BamH I 法将产物片段连接到 pTRV2 载体上 之后转入大 肠杆菌 DH5 阳性单菌落进行 PCR 菌落筛选 送广州擎科生物科技有限公司测序 确定重组子 将阳性单菌落进行扩摇 提取重组质粒 pTRV2 SmWRKY65 后转入农杆菌 GV3101 用于侵染 1 2 8 农杆菌侵染茄子幼苗 将抗病和感病茄子 种子分别播种在含泥炭和珍珠岩的混合基质中 于 25 16 h 光照和 8 h 黑暗的培养室中进行培 养 当茄子幼苗长至 3 4 片真叶时 吸取含有重 组质粒 pTRV2 SmWRKY65 的阳性菌落扩摇后 配制成侵染液 并将分离到的青枯菌采用伤根断 根法对茄子幼苗进行侵染 青枯菌的分离与接种 参照曹必好等 21 的方法 每组 15 株 3 次重复 之后在 16 60 的相对湿度下暗处理 1 d 随后置于培养室中生长 3 d 后采用断根法接种 青枯病菌 观察其表型变化并拍照 2 周后调查 统计病情指数 方法参照 Chen 等 22 之后通过 qRT PCR 法测定 pTRV2 SmWRKY65 沉默植株表 达量 试验数据采用 SPSS Statistics 17 0 进行 t 检验 采用 Excel 2010 制图 2 结果与分析 2 1 SmWRKY65 基因的克隆 以茄子叶片 cDNA 为模板 通过 PCR 扩增 得 到 948 bp 的 SmWRKY65 片段 经 1 琼脂糖 凝胶电泳 结果显示目的条带与预期结果一致 图 1 将目的条带切胶回收 纯化 测序 对 SmWRKY65 测序序列与 WRKY65 原始序列 登 录号 Sme2 5 00423 1 g00013 1 在 DNAMAN 8 0 工具上进行比对 结果显示同源性为 88 06 表 明在茄子中成功克隆了 SmWRKY65 图 2 M 2000bp 1000bp 750bp 500bp 250bp 100bp 948bp 1 M DNA Marker DL2000 1 SmWRKY65 电泳条带 M DNA Marker DL2000 1 SmWRKY65 electrophoresis band 图 1 SmWRKY65 电泳结果 Fig 1 Electropherogram result of SmWRKY65 2 2 SmWRKY65 蛋白的生物信息学分析 S m W R K Y 6 5蛋白理化性质分析结果显 示 该基因开放阅读框为 834 个核苷酸序列 编码2 7 7个氨基酸残基 蛋白相对分子量大 表 1 引物序列 Table 1 Primer sequences 引物名称 Primer name 序列 5 3 Sequence 5 3 SmWRKY65 F ATGGAAGATAGGCTATACAAAAGTC SmWRKY65 R TTATCCTGTACCGCCGCAAC q SmWRKY65 F GGATATTATCGATGCAGTAG q SmWRKY65 R GGTAGATGTGGTAGGTGAAC 18S rRNA F CGCGCGCTACACTGATGTATTCAA 18S rRNA R TACAAAGGGCAGGGACGTAGTCAA SmWRKY65 GFP EB F gataagcttgatatcgaattcATGGAAGATAG TTCATACAAAAATCTATTTT SmWRKY65 GFP EB R tttacccatactagtggatccTCCTGTACCTCC GCAGCAGG pTRV2 WRKY65 F TAAGGTTACCGAATTCGGATATTA TCGATGCAGTAG pTRV2 WRKY65 R GCTCGGTACCGGATCCGGTAGAT GTGGTAGGTGAAC 46 小 为 30 155 21 ku 等 电 点 为 5 51 分 子 式 为 C 1304 H 1998 N 30 O 430 S 13 原子总量为 4 115 预测该蛋 白属于亲水性蛋白 对 SmWRKY65 蛋白的二级 结构进行预测 结果显示 其主要由不规则盘绕 结构 72 92 螺旋 12 27 延伸链 11 91 和 转角 2 89 等结构元件组 成 图 3 预测该蛋白属于 W R K Y 家族 在 71 131 区域具有 1 个含 60 个氨基酸的 WRKY 保 守域 可以特异结合 DNA 序列 T T TGAC C T 具有 DNA 结合位点 3 个 蛋白结合位 点 3 个 核苷酸多肽链结合位点 2 个 大分子结 合区域 7 个 主要多集中在 WRKY 家族的保守结 构域内 预测该基因定位于细胞核中 图 4 通过 NCBI 上 Blast 在线比对工具 将检索到的 12 条与 SmWRKY65 同源性较高的基因进行多序列比 对 使用 MEGA 7 0 21 软件构建进化树 结果表 明 茄子 SmWRKY65 与马铃薯 番茄的 WRKY65 同源性最高 图 5 WRKY65 SmWRKY65 Consensus 80 73 160 153 240 230 320 310 400 390 480 470 560 550 640 630 720 710 800 790 880 870 888 950 888 952 WRKY65 SmWRKY65 Consensus WRKY65 SmWRKY65 Consensus WRKY65 SmWRKY65 Consensus WRKY65 SmWRKY65 Consensus WRKY65 SmWRKY65 Consensus WRKY65 SmWRKY65 Consensus WRKY65 SmWRKY65 Consensus WRKY65 SmWRKY65 Consensus WRKY65 SmWRKY65 Consensus WRKY65 SmWRKY65 Consensus WRKY65 SmWRKY65 Consensus WRKY65 SmWRKY65 Consensus 图 2 SmWRKY65 序列比对结果 Fig 2 Comparison result of SmWRKY65 sequences 47 XP 010323672 1 WRKY65 isoform X1 Solanum lycopersicunm XP 015081016 1 WRKY65 isoform X1 Solanum pennellii XP 015081017 1 WRKY69 isoform X2 Solanum pennellii XP 006348892 1 WRKY65 isoform X1 Solanum tuberosum XP 006348893 1 WRKY69 isoform X2 Solanum tuberosum Sme2 5 00423 1 g00013 1 SmWRKY Solanum melongena XP 004243269 1 WRKY69 isoform X2 Solanum lycopersicunm XP 016580885 1 WRKY65 isoform X1 Capsicum annuum KAF3641841 1 WRKY69 like isoform X2 Capsicum annuum XP 016580886 1 WRKY65 isoform X2 Capsicum annuum PHT76738 1 hypothetical protein T459 20260 Capsicum annuum PHU12509 1 WRKY14 Capsicum chinense PHT43547 1 WRKY14 Capsicum baccatum 56 64 98 56 58 0 05 图 5 SmWRKY65 同源进化树分析 Fig 5 Analysis of homologous tree of SmWRKY65 2 3 SmWRKY65 的时空表达模式和亚细胞定位 分析 以茄子叶片 cDNA 为模板 通过 PCR 检测 SmWRKY65 荧光定量引物的特异性 经 1 琼脂 糖凝胶电泳 结果显示在 250 bp 左右有 1 条明亮 且符合预期的条带 图 6A 说明引物特异性较 好 可用于后续试验 对茄子根 茎 叶不同组 织部位表达量的分析结果显示 SmWRKY65 在茄 子根组织部位中的表达量最高 在叶中的表达量 次之 茎中最低 图 6B 在茄子苗期接种青枯 病菌后 0 3 6 9 h 4 个时间段分别采集抗病 10 20 30 40 50 60 70 h 螺旋 e 延伸链 c 不规则盘绕结构 t 转角 h helix e Extended strand c Random coil structure t turn 图 3 SmWRKY65 蛋白二级结构预测 Fig 3 Secondary structure prediction of SmWRKY65 protein 图 4 SmWRKY65 蛋白结合位点和亚细胞定位预测 Fig 4 Binding sites and subcellular localization prediction of SmWRKY65 protein Query seq Specific hits Superfamilies Protein Protein Protein Polynucelotide Binding Sites Prediction Protein Disorder and Flexibility Prediction Secondary Structure and Solvent Accessibility Prediction Subcellular Localization Prediction WRKY WRKY superfamily 50 1 100 150 200 250 277 277 48 感病植株叶片进行实时荧光定量分析 结果表明 SmWRKY65 在抗病和感病材料中的表达量均随接 种时间延长逐渐升高 9 h 时达到最高 且在抗病 材料中的表达水平明显高于在感病材料中的表达 水平 图 6C 说明 SmWRKY65 响应茄子青枯 病抗性相关基因的表达 使用 EcoR I 和 BamH I 酶对亚细胞定位载体 pC018 和亚细胞定位引物成功克隆出的 PCR 片段 进行双酶切 并连接成大小为 831 bp 的重组质粒 SmWRKY65 GFP 图 7A 将重组质粒转化农杆 菌后转化洋葱表皮细胞 在共聚焦显微镜下观察 到 SmWRKY65 定位在细胞核中表达 图 7B 2000bp 1000bp 35S GFP 空载 35S GFP vector control 明场 Bright GFP 荧光 GFP fluorescence 叠加图像 Merge 35S SmWRKY65 GFP 750bp 500bp 250bp 100bp A M 1 B 831bp M DNA Marker DL2000 1 SmWRKY65 GFP 电泳条带 M DNA Marker DL2000 1 SmWRKY65 GFP electrophoretic bands 图 7 SmWRKY65 亚细胞定位分析 Fig 7 Subcellular localization analysis of SmWRKY65 接种时间 Vaccination time h R bw S bw C SmWRKY65 相对表达量 SmWRKY65 relative expression levels 0 0 3 6 9 3 6 9 2 5 2 1 5 1 0 5 0 A SmWRKY65 相对表达量 SmWRKY65 relative expression levels M 2000bp 1000bp 750bp 500bp 250bp 100bp 根 Root 茎 Stem 叶 Leaf 组织部位 Tissue 1 0 5 0 1 B M DNA Marker DL2000 1 SmWRKY65 荧光定量 PCR 产物 R 抗病型茄子 E 31 S 感病型茄子 E 32 bw 接种青枯病 M DNA Marker DL2000 1 Fluorescence quantitative PCR products of SmWRKY65 R Disease resistant eggplants E 31 S Disease susceptible eggplants bw Bacterial wilt inoculation 图 6 茄子不同组织及抗感病植株中 SmWRKY65 的表达分析 Fig 6 SmWRKY65 expression of different tissues and disease resistant and disease susceptible plants of eggplant 49 这与预测结果一致 2 4 SmWRKY6 沉默在抗病茄子中响应青枯病的 情况 2 4 1 pTRV2 SmWRKY65 载体构建结果 以茄 子叶片为材料提取 RNA 并通过逆转录反应合成 cDNA 再以 cDNA 为模板 利用构建 VIGS 载体 所设计的特异性引物进行 PCR 扩增 1 琼脂糖 凝胶电泳显示 获得长度为 242 bp 的 PCR 产物 图 8A 将产物片段和 pTRV2 载体同时用 EcoR I 和 BamH I 进行双酶切后成功将 SmWRKY65 连接 到 pTRV2 载体上获得重组质粒 经测序保证连接 片段和读码方向正确后转入农杆菌 GV3101 从 阳性菌落检测结果来看 与 pTRV2 图 8B1 空 载相比 pTRV2 SmWRKY65 图 8B2 载体构建 成功 2 4 2 青枯病菌接种 VIGS 沉默植株 为了验证 pTRV2 WRKY65 沉默植株对茄子青枯病的响应情 况 在 3 4 片真叶时 对茄子抗病植株接种青枯 病病原菌 接种 7 d 后观察到接种清水的叶片均 没有表现出明显的萎蔫症状 接种 pTRV2 空载 的植株仅有 1 片叶片出现萎蔫 而接种 pTRV2 WRKY65 的 15 株植株几乎全部表现出萎蔫症状 接种 2 周后 对 pTRV2 WRKY65 植株进行病情指 数调查 结果 表 2 表明 SmWRKY65 基因被 沉默后影响了抗病材料对青枯病的抵御能力 即 表现为感病症状 pTRV2 SmWRKY65 实时荧光定 量检测结果 图 9 显示 与清水和 pTRV2 空载 相比 pTRV2 SmWRKY65 表达量明显下降 表 2 VIGS 沉默植株的病情指数统计 Table 2 Statistics of disease index of VIGS silent plants 材料 Material 试验重复 Test repetition times 评估分级 Scale of evaluation 0 1 2 3 4 清水 Water 1 15 0 0 0 0 2 15 0 0 0 0 3 15 0 0 0 0 pTRV2 空载 pTRV2 control vector 1 15 0 0 0 0 2 14 1 0 0 0 3 14 1 0 0 0 pTRV2 WRKY65 1 0 2 8 5 0 2 0 3 8 3 1 3 0 4 7 4 0 注 评估分级标准为 0 表示没有叶片枯萎 1 表示 1 2 片叶子枯萎 2 表示 3 片以上叶子枯萎 3 表示所有叶子枯萎 4 表示死亡 0 2 级被 认为抗青枯病 3 4 级被认为感病 Note The standard of scale of evaluation 0 healthy 1 one or two leaves wilted 2 three or more leaves wilte