2020-植物转录因子研究方法_周蒋毅周倩

Botanical Research 植 物学 研究 2020 9 1 25 30 Published Online January 2020 in Hans http www hanspub org journal br https doi org 10 12677 br 2020 91003 文 章引用 周蒋毅 周倩 植物 转录因子研究方法 J 植物学 研究 2020 9 1 25 30 DOI 10 12677 br 2020 91003 Research Method of Transcription Factors in Plant Jiangyi Zhou Qian Zhou College of Chemistry and Life Sciences Zhejiang Normal University Jinhua Zhejiang Received Nov 20 th 2019 accepted Dec 23 rd 2019 published Dec 30 th 2019 Abstract Plant transcription factors regulate the expression of vast downstream genes and play an important role in the regulation of plant growth and development as well as its response to environment With the development of transcription factors in model plants and crops the research methods of transcription factors are also being innovated We describe the research methods of plant tran scription factors from two aspects protein protein interaction and target gene protein interaction so as to provide a reference method for the related research of plant transcription factors Pro tein protein interaction methods include yeast two hybrid system fluorescence resonance ener gy transfer bimolecular fluorescence complementation pull down and co immunoprecipitation methods for target gene protein interaction include yeast one hybrid system chromatin immu noprecipitation electrophoretic mobility shift assay and luciferase reporter assay Keywords Plant Transcription Factor Transcription Control Protein Protein Interaction Target Gene Protein Interaction 植物转录因子研究方法 周蒋毅 周 倩 浙江师范 大学化 学与生 命科 学学院 浙江 金华 收稿日期 2019年11 月20 日 录用日 期 2019年12月23日 发布 日期 2019 年12月30日 摘 要 植物转录因 子可以 调控众 多 下游基因的 表达 在植物 的 生长发育 响应外 界环境 刺 激等方面起 着重要 的周蒋毅 周倩 DOI 10 12677 br 2020 91003 26 植物学研究 调控作用 随着转 录因子 在 模式植物和 作物中 基因转 录 调控的研究 不断深 入 转 录 因子研究方 法也在 持 续创新 我们主 要从蛋 白质 与蛋白质 互作和 靶基因 与蛋 白质互作 这2个方面 阐述植 物转录因 子研究 方法 为植物转录 因子的 相关研 究 提供参考方 法 蛋 白质与 蛋 白质互作的 方法主 要有 酵 母双杂交系 统 荧 光 共振能量转 移技术 双分 子 荧光互补技 术 下 拉实验 和 免疫共沉淀 技术 靶基因 与 蛋白质互作 的方法 主 要有 酵 母单杂 交系统 染 色质免疫 沉淀技 术 凝 胶电 泳迁移技 术和荧 光素酶 报告 系统 关 键词 植物转录 因子 转录调 控 蛋白质与 蛋白质 互作 靶基 因与蛋白 质互作 Copyright 2020 by author s and Hans Publishers Inc This work is licensed under the Creative Commons Attribution International License CC BY http creativecommons org licenses by 4 0 1 引言 转录因子 Transcription Factor TF 也称反式作用 因子 其 可直接或 间接与 基因启 动子 区域中顺 式作用 元件特 异性结 合 对基因 转 录进行 调控的 蛋白 质 1 其 主要功 能是激 活或 抑制基 因 的转录 效应 典型的 转录因子一般具有 4 个功能结构域 即 DNA 结合结构域 DNA Binding Domain 转录调控结构域 Transcription Regulation Domain 核 定位信 号区 Nuclear Location Signal 和寡聚 化位 点区 Oligomerization Site DNA 结 合结构 域特异 性结合顺 式作用 元件 转录 调控结构 域激活 或抑制 靶基 因表达 核定位 信号 区 是转录因 子中富 含精氨酸和 赖氨酸残 基的核 定位区域 转录因子 进人细 胞核的 过程 受该区段 控制 寡 聚化位点 区是不 同转录 因子 借以发生 相互作 用的功 能域 这些结 构域共 同调节 靶基 因的转录 起始 1 2 转录因子 在植物 的生长 发育 及对外界 环境刺 激等方 面发 挥着重要 的调控 作用 从 1987 年 Paz AerS 首 次报道玉 米转录 因子基因的 克隆以来 相继 从高等植物 中分离出 的调控 干旱 高盐 低温 激素 病 原反应及 生长发 育等相 关基 因表达的 转录因 子已达 数百 种 3 植物中约 有 58 个转录因子家 族 4 其中 有 6 个 转录因 子家族 据研究 报道参与 了生物 和非生 物胁 迫反应 如 AP2 ERF APETALA2 乙 烯响应 因子 bHLH 基础 螺旋 环 螺旋 MYB 与成髓细胞 相关 NAC 无顶 端分生 组织 NAM 拟南芥转 录激 活 因子 ATAF1 2 杯状 子叶 CUC2 WRKY 和 bZIP 碱性亮氨酸 拉链 5 6 随着转录 因子在 模式植 物和 作物中基 因转录 调控的 研究 不断深入 转录因 子研究 方 法也在持 续创新 我们主要 从蛋白 质与蛋 白质 互作和靶 基因与 蛋白质 互作 这 2 个方面阐述 植物转 录因 子研究方 法 2 蛋 白质 与蛋 白质互作 2 1 酵母双杂交系统 酵母双杂 交系统 Yeast two hybrid system Y2H 于 1989 年首次开 发 彻底 改变了 寻 找和鉴定 互作蛋 白 的过程 7 该系 统根据 酵 母 GAL4 转 录因子 的特性 由 DNA 结合 结构域 Binding Domain BD 和转录激 活结构域 Activation Domain AD 组 成 DNA 结合结 构域 由 GAL4 N 端 1 147 位氨基酸残基组 成 转 录激 活结构域 由 C 端 768 881 位氨基酸残 基组成 8 这 两个 结构域之 间由大 的结构 区域 隔开 独 立且功 能稳 定 一般情 况下 单独 的 BD 结合 DNA 上 游激活 序列 Upstream Activating Sequence UAS 但 不引起 转录 单独的 AD 不 能与 UAS 结 合 只有当 两个相 互作用 的 蛋白质分 别与 BD 和 AD 融 合时 它们 的相互 作用 产生嵌合 型转录 因子从 而引 起启动子 下游基 因的转 录 Open Access周蒋毅 周倩 DOI 10 12677 br 2020 91003 27 植物学研究 依据此特 性 将编码 已知蛋 白 诱饵蛋白 Bait 的基 因 构建到含 有 BD 序列的 载体 上 在 酵母中 表达 产生融合 蛋白 BD Bait 将 编码未知 蛋白 猎物 蛋白 Prey 的基因 构建到 含有 AD 序列的载 体上 在酵母 中表达产 生融合 蛋 白 AD Prey 当 BD Bait 与 AD Prey 在酵母核 中相互 作用时 DNA BD 和 AD 接 近以 恢复功能 性 GAL4 转录激 活 因子 前 者与报 告基因 如 lacZ ADE2 HIS3 和 MEL1 的 UAS 结合 从而 启动报 告基因 的表 达 8 因 此可以 通过判 断酵 母克隆 能 否在与 报告基 因对 应的营 养 缺陷型 培养基 上生长 来证明两 个蛋白 是否存 在相 互作用 与其它的 研究蛋 白质相 互作 用的方法 相比 假 阴性 假 阳性以及 互作蛋 白的强 制性 核定位是 Y2H 的 局限 当然 Y2H 有其独 特 的优点 首 先 Y2H 不仅 可 以检测稳 定的相 互作用 蛋白 还可以检 测弱而 短暂 的蛋白相 互作用 9 第 二 由 于 Y2H 是在酵 母细胞 核 内进行的 因此检 测的蛋 白 质可能以 天然构 象存在 8 第三 Y2H 是对 生化方 法 如免疫共 沉淀和 质谱分 析 的补充 9 10 近年来 Y2H 得到了很大 的改进 不仅可以 应用于 蛋白质 DNA 相 互作用 11 和酵母 三杂 交 12 还可以用 于膜蛋 白 DNA 结合蛋 白和 RNA 结合蛋白 的相互 作用研 究 13 2 2 荧光共振能量转移技术 高 端共聚 焦显微 镜和荧 光蛋白 的发展 促进了 亚细胞 尺度的 蛋白质 分析 荧 光共振能 量转 移 Fluorescence Resonance Energy Transfer FRET 是 指处 于激 发态的供 体荧 光蛋白 将能量 以非 辐射 的方 式转移 到附近 的 受体分子 14 发 生 FRET 必须有三 个先决 条件 1 供体发射 和受体 吸收的 光谱 重叠区域 必须有 有效的 能量转移 2 荧光 基团之 间 的距离必 须小于 10 nm 3 荧光基团 的双极 取向必 须以 理想的平 行方式 对齐 虽然 FRET 常用于蛋 白质相 互作用 但其实 际上是 通过 理论计算 来检测 15 有很多方 法可以 检测到 FRET 每种方法都各 有好处 和 缺陷 目 前有三 种最常 用的 技术 1 敏化发 射测量 FRET SE 2 受体光漂白 FRET AB 3 荧光 寿命成像 FRET FLIM 敏化发射 测量 FRET SE 主 要用于动 态检测 活细胞 中的 FRET 效率 16 FRET SE 的限制在 于每次实 验需要利 用至少 3 个 对照样 本对光学 检测系 统以及 荧光 基团的光 学性质 进行事 先校 正 一旦 校正完 成 后续实验 不能再 改变任 何系 统参数 且每次 实验都 要重 新校正 这极大 地增加 了实 验的工作 量和难 度 受体光漂 白 FRET AB 通过 检测光漂 白受体 漂白前 后供 体的荧光 强度来 获得 FRET 效率 17 这是一 种直接的 方法 不需要 高端 显微镜 也不受 光谱影 响 可以自己 控制样 品 荧光寿命成像显微术 FRET FLIM 主要通过测 量受体存 在和不存在时的供体 分子的 荧光寿命来确定 FRET 效率 18 这是一种 不受光谱 供体 或受体 浓度 差异 激 发强度 变化和 光漂 白影响的 技术 19 其 限制因素 主要是 系统价 格昂 贵 而且 需要熟 练的操 作人 员进行操 作 2 3 双分子荧光互补技术 双分子荧 光互补 技术 Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC 最初 从大肠 杆 菌发展而 来 后 来广泛适 用于哺 乳动物 和植 物系统 20 其原 理是将 荧光 蛋白在合 适的位 点切开 形成 不发荧光的 N 端和 C 端片段 这 2 个片段 借助融 合于其上 的目标 蛋白的 相互 作用 彼 此靠近 重新形 成具 有活性的 荧光蛋 白 并在该荧 光蛋白 的激发 光激 发下发射 荧光 尽管 BiFC 被广泛应 用 但 它受到 两个 主要限制 1 估计半 衰期为 10 年的分 裂荧光 蛋 白片段的 不可逆 互补排 除了 相互作用 动力学 的分析 2 大多数分裂 片段可 以 不受阻碍 地自发 重新组 装 这些缺陷 增加了 假阳性 的可 能 2 4 Pull down 和免疫共沉淀技术 Pull down 技术主 要在体 外 验证两种 蛋白之 间是否 存在 直接的相 互作用 主 要有两 种常用的 pull down 方法 一 种是用 谷胱甘 肽巯 基转移酶 Glutathione s Transferase GST 标签 GST tag 的亲和纯 化柱进 行的 周蒋毅 周倩 DOI 10 12677 br 2020 91003 28 植物学研究 称为 GST pull down 一种 是用带组 氨酸 Histidine His 标签 His tag 的亲和 纯化柱 进行的 称为 His pull down 21 以 GST pull down 为例 首先是 获得带 有 GST 标签的融合蛋白 然后将 带有 GST 标签的融合 蛋 白亲和到 谷胱甘 肽层析柱上 接着将 与融合 蛋白发生相 互作用的 蛋白被 亲和到 谷胱 甘肽层析 柱上 最 后切掉标 签 洗 脱得到 相互 作用的蛋 白 免疫共沉 淀技术 Co Immunoprecipitation Co IP 以抗体和 抗原之间 的专一 性结合 作用 为基础 用 于检 测 和确定生 理条件 下蛋白质之 间的相互 作用 其基本原理 是将细胞 在非变 性条件 下裂 解 在细 胞裂解 液 中 加入特异 性的抗 体 这样抗 体可以和 已知的 抗原形成抗 原 抗体 复合物 如果 在系 统中存在 与已知 抗 原 相互作用 的蛋白 质 该蛋白 质也会以 复合物 的形式沉淀 下来 经 过洗脱 就可以 得到 与已知抗 原相互 作 用的蛋白 质 然 后进行 SDS PAGE 及 Western blotting 分析 22 该技术研 究的相 互作用的 蛋白质 都是经 翻 译后修饰 的处于 天然状态的 因此可 避免人 为的影响 同时可分 离得到 天然状 态的 相互作用 蛋白复 合 物 但 Co IP 难 以检测 到 弱或瞬时 相互作 用 此 外 多个相互 作用蛋 白质复 合物 的存在也 可引 起 Co IP 中的相互 作用 3 靶 基因 与蛋 白质互作 3 1 酵母单杂交系统 酵母单杂 交系统 Yeast one hybrid system Y1H 由酵 母双 杂交系统 发展而 来 是 一种 在酵母细 胞内分 析与鉴定 转录因 子和 DNA 顺式作用 元件相 互结合 的有 效方法 12 依据此原理 构 建目的基 因与转 录激活 结 构域融合 的载体 将顺式作 用元件和 报告基 因分别连在 启动子的 上游和 下游 转录 激活域融 合蛋白 与 特异的 DNA 序列结 合激活 启动子下 游报告 基因表 达 因此可以 通过判 断酵母 克隆 能否在与 报告基 因对应 的营养缺 陷型培 养基上 生长 来证明目 的蛋白 能否与 DNA 序 列结合 由于酵 母单杂 交系统常 常受所 用报告 基 因的影响 较高 的假阳性一 直是该技 术的 瓶颈 问题 此外 在酵母 单杂交 系统 中 假阴 性一直 被 忽 略 如某 些外源 基因的蛋白 表达产物 可能对 酵母本身有 毒性作用 影响 酵母细 胞的 生长和表 型 而这 其中可能 就包含 着与靶 DNA 序 列相互 作用的 蛋白 3 2 染色质免疫沉淀技术 染色质免 疫沉淀 技术 Chromatin Immunoprecipitation ChIP 是一种利用抗原 抗体 反应 的特异性 在染 色质水平 上真实 反映体 内基 因组 DNA 与 蛋白质 结合情 况的转录 调控技 术 其原 理 是在生理 条件下 把细胞 内的 DNA 与 蛋白质 交联在 一起 通过 超声波 将染色 质 随机切成 小片段 利用抗 原 抗体的特 异性识 别反应 将与目的 蛋白结 合的 DNA 沉淀下来 检测 目的片段 得 到蛋白质 与 DNA 相 互作用 信息 23 Chip 实验 涉 及众多的 实验步 骤 包 括细 胞固定 染色质 断裂 染色 质免疫沉 淀 解 交联 DNA 的纯 化以 及 DNA 的 鉴定 而 且结果 的重复 性较 低 因此 对 Chip 实验过 程 的每一步 都应设 计相应 的对 照 近年来发 展起来的 Chip seq 技术将染色质 免疫沉 淀技 术 Chip 与芯片技 术和第 二 代测序技 术 seq 相 结合 用 来进行 靶基因 的高 通量筛选 为研 究目的 蛋白 与整个基 因组相 互作用 提供 了可能 3 3 凝胶电泳迁移技术 凝胶电泳 迁移技 术 Electrophoretic Mobility Shift Assay EMSA 又称为 电泳迁 移率改 变分析技 术和凝 胶阻滞实 验 这是一 种利用 探针体外 分析 DNA 与蛋白 质相互作 用的凝 胶电泳 技术 24 其原理是蛋白 质 和 DNA 结合 后增 加了 相 对分子 质量 在 非变性 聚丙 烯酰胺 凝胶 电泳 中 DNA 蛋白质 复合 物与 单一的 DNA 片段 相比 前者迁 移 速度明显 较慢 具体方 法是 将含有假 定蛋白 质结合 位点 的已标记 DNA 片段 与 纯化蛋白 进行孵 育 然 后将 反应产物 进行非 变性聚 丙烯 酰胺凝胶 电泳分 析 传统的 32P 标记探针的凝 胶周蒋毅 周倩 DOI 10 12677 br 2020 91003 29 植物学研究 阻滞实验 具有很 高的灵敏度 但会接 触到危 险性的放射 性同位素 且不容 易定量 分析 即使现 在有很 多 研究报道 利用非 放射性 标记 的凝胶阻 滞实验 但非 放射 性标记探 针的凝 胶阻滞 试剂 盒的费用 很高 3 4 荧光素酶报告系统 荧光素酶 报告系 统 Luciferase reporter assay 指的 是以荧 光素为底 物来检 测荧光 素酶 活性的检 测系统 25 荧光素酶是一种 广泛 使用的报 告基因 其可 以催 化荧光素 氧化成 氧化荧 光素 在荧光 素氧化 的过程 中 会发出 生物荧 光 bioluminescence 荧光 素和荧 光素 酶这一发 光系统 具有极 高的 灵敏性 荧 光素酶 不 仅可以作 为一种 报告基 因进 行检测分 析 还可 以用于 化 学污染物 的监测 与分析 此 外还可以 用于 RNA 干 扰的研究 蛋白 质之间 作用 的研究及 微生物 检测等 应 用前景十 分广阔 26 4 结论 转 录调控在 拟南芥 水稻等模 式植物和 作物中的 研究越来 越多 转 录调控技 术的应用 有助于更 好 地 阐 明植物内 部的转 录调控机制 在这篇 综述中 我们从蛋 白质与蛋 白质互 作和靶 基因 与蛋白质 互作 这 2 个方面总 结了植 物转录 因子 主要分析 方法 以期为 植物 转录因子 的相关 研究提 供参 考方法 参考 文献 1 刘强 张贵友 陈受宜 植物转 录因子的结构与调控作用 J 科学通报 2000 45 14 1465 1474 2 Liu L White M J and MacRae T H 1999 Transcription Factors and Their Genes in Higher Plants European Journal of Biochemistry 262 247 257 https doi org 10 1046 j 1432 1327 1999 00349 x 3 Paz Ares J Ghosal D Wienand U et al 1987 The Regulatory c1 Locus of Zea mays Encodes a Protein with Homology to Myb Proto Oncogene Products and with Structural Similarities to Transcriptional Activators The EMBO Journal 6 3553 3558 https doi org 10 1002 j 1460 2075 1987 tb02684 x 4 Jin J Tian F Yang D C et al 2017 Plant TFDB 4 0 Toward a Central Hub for Transcription Factors and 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