Cf-19介导的抗番茄叶霉病(Cladosporium fulvum)免疫应答酵母双杂交cDNA文库.pdf

Cf 19 介导的抗番茄叶 霉病 Cladosporiumfulvum 免疫应答 酵母双杂交 cDNA 文库构建和鉴定 许向阳 1 2 裴 童 1 吴泰茹 1 王子玉 1 赵婷婷 1 李景富 1 杨欢欢 1 姜景彬 1 张 贺 1 1 东北农业大学园艺园林学院 哈尔滨 150030 2 农业农村部东北地区园艺作物生物学与种质创制重点实验室 哈尔滨 150030 摘 要 番 茄 叶 霉 病 Cladosporium fulvum 是 番 茄 栽 培 生 产 中 最 严 重 的 病 害 之 一 造 成 严 重 经 济 损 失 Cf 19 基 因 是 目 前 已 知 抗 性 最 强 抗 性 范 围 最 广 的 叶 霉 病 抗 病 基 因 之 一 其 免 疫 应 答 过 程 具 有 代 表 性 为 研 究 Cf 19 介 导 的 免 疫 应 答 过 程 中 蛋 白 质 互 作 机 制 采 用Gateway 技 术 构 建 Cf 19 介 导 的 抗 番 茄 叶 霉 病 免 疫 应 答 酵 母 双 杂 交 cDNA 文 库 结 果 表 明 酵 母cDNA 文 库 滴 度 为5 0 10 7 CFU mL 1 重 组 率 为100 cDNA 文 库 插 入 片 段 长 度500 2000bp 插 入 片 段 平 均 长 度1000bp 以 上 由 此 可 知 Cf 19 介 导 的 抗 番 茄 叶 霉 病 C fulvum 免 疫 应 答 酵 母 双 杂 交cDNA 文库 可用于筛选互作蛋白 关键词 番茄 叶霉病 cDNA 文库 酵母双杂交 中图分类号 S641 2 文献标志码 A 文章编号 1005 9369 2020 05 0010 07 许 向 阳 裴 童 吴 泰 茹 等 Cf 19 介 导 的 抗 番 茄 叶 霉 病 Cladosporium fulvum 免 疫 应 答 酵 母 双 杂 交cDNA 文 库 构 建 和 鉴 定 J 东 北 农 业 大 学 学 报 2020 51 5 10 16 DOI 10 19720 ki issn 1005 9369 2020 05 0002 Xu Xiangyang Pei Tong Wu Tairu et al Construction and identification of yeast two hybrid cDNAlibrary for Cf 19 mediated resistance to Cladosporium fulvum infection in tomato J Journal of NortheastAgricultural University 2019 51 5 10 16 in Chinese with English abstract DOI 10 19720 ki issn 1005 9369 2020 05 0002 Construction and identification of yeast two hybrid cDNA library for C f 19 mediated resistance to C l a d o s p o r i u m f u l v u m infection in tomato XUXiangyang 1 2 PEITong 1 WUTairu 1 WANGZiyu 1 ZHAOTingting 1 LIJingfu 1 YANGHuanhuan 1 JING Jingbin 1 ZHANG He 1 1 School of Horticulture and Landscape Architecture Northeast Agricultural University Harbin 150030 China 2 Key Laboratory of Biology and Genetic Improvement Horticultural Crops Northeast Region Ministry ofAgriculture and RuralAffairs Harbin 150030 China Abstract Cladosporium fulvum is one of the most serious diseases in tomato cultivation and production whicecancauseseriouseconomiclossestotomatoproduction Cf 19geneisoneofthe geneswiththestrongestresistanceandthewidestrangeofresistancetoCladosporiumfulvum andits immuneresponseprocessiswellrepresented Inordertostudytheproteininteractionmechanisminthe immune response process mediated by Cf 19 Gateway technology was used to construct a Cf 19 mediatedyeasttwo hybridcDNAlibraryforimmuneresponse Thestudyshowedthatthetiterofyeast cDNAlibrarywas5 0 10 7 CFU mL 1 therecombinationratewasupto100 thelengthoftheinserted fragmentwas500 2000bp andtheaveragelengthoftheinsertedfragmentofcDNAlibrarywasmore 收稿日期 2020 05 02 基金项目 黑龙江省自然科学基金项目 C2017024 中国博士后科学基金项目 2018M630333 作者简介 许 向 阳 1969 男 研 究 员 博 士 博 士 生 导 师 研 究 方 向 为 番 茄 分 子 遗 传 育 种 E mail xxy709 JournalofNortheastAgriculturalUniversity 东 北 农 业 大 学 学 报 第51 卷 第5 期 51 5 10 16 2020 年5 月 May2020番 茄 叶 霉 病 是 番 茄 栽 培 生 产 中 常 见 病 害 多 发 于 高 温 高 湿 环 境 番 茄 生 长 发 育 时 期 均 可 发 病 1 叶 霉 病 发 病 初 期 植 株 下 端 老 叶 开 始 出 现 黄 色 斑 点 发 病 中 期 番 茄 叶 片 背 部 由 黄 色 病 斑 转 为 白 色 霉 层 发病后期植株叶片出现黑 褐色霉层 最终整株 番 茄 叶 片 布 满 黑 褐 色 霉 层 致 植 株 死 亡 对 番 茄 产 量 与 品 质 影 响 极 大 2 番 茄 叶 霉 菌 Cladosporium fulvum C fulvum 是 一 种 褐 孢 霉 属 真 菌 属 于 丝 孢 目 暗 色 孢 科 3 该 病 菌 与 番 茄 植 株 发 生 亲 和 作 用 真 菌 孢 子 在 叶 片 背 面 萌 发 菌 丝 从 气 孔 中 产 生 并 继 续 生 长 和 繁 殖 最 后 受 感 染 细 胞 发 生 坏 死 4 研 究 表 明 Cf 基 因 家 族 可 赋 予 番 茄 植 株 对 C fulvum 菌 的 抗 性 当 菌 丝 进 入 气 孔 后 Cf 基 因 产 物 识 别 C fulvum 的Avr 产 物 使 番 茄 植 株 与 病 原 菌 之 间 发 生 非 亲 和 互 作 使 菌 丝 进 入 气 孔 后 停 止 生 长 4 Cf 基 因 对 C fulvum 的 抗 性 过 程 复 杂 由 于 Cf 基 因 属 于 典 型 的RLP 类 受 体 蛋 白 Cf 蛋 白 通 过 结 合 其 他 蛋 白 以 复 合 体 形 式 发 挥 调 控 功 能 因 此 其 互 作 蛋 白及下游调控途径中重要 互作关系挖掘是解析抗病 应答 机制 的关 键 目前 Cf 介导 的免 疫应 答过 程研 究 主 要 集 中 在 Cf 4 和 Cf 9 上 其 进 化 关 系 较 近 序 列 相 似 度 较 高 但 形 成 复 合 体 及 下 游 调 控 信 号 差 异 较 大 使 Cf 家 族 调 控 机 制 研 究 更 加 复 杂 5 Cf 19 基 因 作 为 Cf 基 因 家 族 典 型 成 员 对 C fulvum 抗 性 较 强 携 带 该 基 因 的 番 茄 植 株 在 田 间 栽 培 中 表 现 显 著 且 抗 性 稳 定 Cf 19 蛋 白 与 植 物 细 胞 中 的 信 号 途 径 和 蛋 白 互 作 网 络 尚 不 清 楚 探 索 该 蛋 白 与 其 他 蛋 白 互 作 分 子 机 制 将 为 Cf 家 族 抗 病 应 答 调 控机制的研究和创新提供新思路 6 7 酵 母 双 杂 系 统 是 筛 选 蛋 白 质 之 间 互 作 最 常 用 最 有 效 和 最 灵 敏 的 方 法 8 该 方 法 可 一 对 一 检 测 两 个 已知蛋白是否存在相互作 用 也可筛选与已知功能 蛋 白 相 关 功 能 代 谢 信 号 传 导 途 径 有 互 作 的cDNA 酵母文库中未确定功能的 未知蛋白 是探索蛋白与 蛋 白 之 间 是 否 存 在 相 互 作 用 的 重 要 手 段 9 近 年 来 随 酵 母 双 杂 交 技 术 研 究 深 入 发 现 该 技 术 可 用 于 筛 选 大 量 新 蛋 白 及 蛋 白 质 新 功 能 等 应 用 10 酵 母 双 杂交技术在各研究领域中 应用广泛 为探索未知蛋 白 分 子 机 理 提 供 可 能 随 着 酵 母 双 杂 交 技 术 的 不 断 完 善 应 用 于 各 种 作 物 领 域 如 在 水 稻 幼 苗 培 育 方 面 建 立 酵 母 双 杂 交cDNA 文 库 11 构 建 外 源ABA 处 理 的 小 麦 与 玉 米 酵 母 双 杂 交cDNA 文 库 12 13 辣 椒 抗 疫 霉 菌 方 面 建 立 酵 母 双 杂 交cDNA 文 库 14 并 应 用 于 花 生 等 栽 培 生 产 领 域 15 为 不 同 作 物 研 究 相 关调控机制发挥重要作用 本 研 究 试 验 材 料 为 番 茄 品 种CGN18423 经 多 年 田 间 试 验 确 定 该 品 种 携 带 抗 番 茄 叶 霉 病 基 因 Cf 19 对 番 茄 植 株CGN18423 侵 染 叶 霉 病 菌 将 侵 染 后0 7 15d 番 茄 材 料 混 合 利 用Gateway 技 术 构 建 Cf 19 介 导 的 抗 番 茄 叶 霉 病 免 疫 应 答 酵 母 双 杂 交cDNA 文 库 以 期 为 深 入 研 究 Cf 19 下 游 调 控 机制奠定基础 1 材料与方法 1 1 植物 材料与叶霉菌侵染 抗 病 材 料CGN18423 携 带 Cf 19 抗 性 基 因 由 中 国 农 业 科 学 院 蔬 菜 花 卉 研 究 所 提 供 叶 霉 病 病 原 菌 来 自 东 北 农 业 大 学 实 验 实 习 与 示 范 中 心 向 阳 基 地 保 存 于 东 北 农 业 大 学 园 艺 园 林 学 院 番 茄 课 题 组 试 验 于2019 年7 月 在 东 北 农 业 大 学 园 艺 实 验 站 育 苗 适 宜 温 度 为25 28 夜 温 不 低 于 12 湿 度75 当 番 茄 长 至4 5 叶 一 心 时 将 培 养 皿 中 叶 霉 病 菌 刮 下 制 作 孢 子 悬 浮 液 喷 洒 植 株 侵 染 叶 霉 病 病 原 菌 保 持 温 度30 湿 度 85 侵 染 病 原 菌0 7 15d 后 选 取 番 茄 叶 片 冻 于 液 氮 中 储存于 80 冰箱 1 2 试验试剂 cDNA 文 库 主 要 试 剂 CloneMiner II cDNA Library Construction Kit FastTrack MAG mRNA isolationKit SuperScriptIIIFirst StrandSynthesis System for RT PCR PureLink TM HQ Mini Plasmid DNAPurificationKitand 等 均 购 自Invitrogen 公 司 Ammoniumacetatesolutionolecularbiology 5M 试 剂 均 购 自SIGMA 公司 1 3 番茄叶片总 RNA 提取与 mRNA 分离 纯化 1 3 1 Trizol 方法提取番茄叶片总RNA 采 取 叶 霉 病 原 菌 侵 染 后0 7 15d 番 茄 叶 片 采 用Trizol 方 法 提 取 Cf 19 介 导 的 抗 番 茄 叶 霉 than1000bp Thelibrarywasofgoodqualityandcould beusedforscreeningofinteractingproteins Key words tomato Cladosporiumfulvum cDNAlibrary yeasttwo hybrid 许向阳等 Cf 19 介导的抗番茄叶霉 病 Cladosporium fulvum 免疫应答酵母双杂交 cDNA 文库构建和鉴定 第5 期 11 病 免 疫 应 答 酵 母 双 杂 交 文 库 总RNA 叶 霉 病 病 原 菌 侵 染 后0 7 15d 番 茄 幼 嫩 叶 片 各 取1g 研 磨 成 粉 末 向 管 中 加 入Trizol 与CH3Cl 后 混 匀 置 于4 离 心 机 中 离 心 吸 取 上 清 液 加 入 同 体 积 异 丙 醇 再 按 上 一 步 骤 离 心 收 集RNA 沉 淀 使 用 预 冷 乙 醇 溶 液 清 洗 管 底 部 白 色 沉 淀 中 残 留 试 剂 杂 质 重 复1 次 上 述 操 作 弃 除 上 清 液 于 无 菌 条 件 下 干 燥RNA 沉淀 溶解于适量DEPC 水中得到总RNA 1 3 2 番茄mRNA 分离与纯化 根 据FastTrack MAG mRNA isolation Kit 与 OligotexmRNAMidiKit 说 明 书 分 离 与 纯 化mRNA 向 总RNA 加 入 水 浴 后buffer OBB 和Oligotex suspension 溶 液 70 水 浴 后 离 心 收 取 沉 淀 向 沉 淀 中 加 入OW2 溶 液 再 次 离 心 离 心 后 加 入buffer OEB 悬 浮 沉 淀 离 心 后 收 集 离 心 液 检 测 质 量 加 入NH4OAC 无 水 乙 醇 与 糖 原 混 匀 静 置 于 80 条 件 离 心 后 收 集 沉 淀 按 照1 3 1 方 法 使 用70 乙 醇 溶 液 清 洗mRNA 沉 淀 最 后 溶 解mRNA 沉 淀 将分 离纯 化后mRNA 通过 电泳 观察 检测 目的 条带 完 整性与片段长度 用于文库构建 1 4 Cf 19 介导的抗番 茄叶霉病免 疫应答酵母 双杂 交初级 cDNA 文库构建 1 4 1 cDNA 双链合成 参 考Invitrogen 公 司cDNA 文 库 构 建 说 明 书 向 纯 化 后mRNA 加 入DEPC 水 5 FirstStrandBuffer 等 相 应 试 剂 合 成cDNA 首 链 cDNA 第 一 条 链 合 成 后 再 向 管 中 加 入DEPC treatedwater 5 SecondStrand Buffer E c o l iDNALigase E c o l iDNAPolymeraseI E coliRNaseH 与T4DNAPolymerase 等 试 剂 离 心 离 心 后 取 上 清 液 加 入Glycogen NH4OAc 100 ethano 于 80 条 件 下 静 置 离 心 收 集 沉 淀 按 照 1 3 1 方 法 清 洗 沉 淀 中 多 余 试 剂 及 杂 质 重 复 此 步 骤 在 室 温 下 吹 干 加 入DEPC 水 获 得 完 整 双 链 cDNA 1 4 2 cDNA 重组接头连接 分级分离与收集 将 合 成 的 双 链cDNA 与 三 框attB1 重 组 接 头 连 接 3 种 接 头 分 别 各 连 接 一 份 将 连 接 后 的cDNA 与10 LigationBuffer T4DNALigase 加 入 柱 子 中 cDNA 分 级 分 离 收 集cDNA 分 级 分 离 后 产 物 添 加 Glycogen 5mol L 1 NH4OAc 100 ethanol 等 试 剂 按 照1 4 1 清 洗 沉 淀 的 方 法 溶 解cDNA 完 成cDNA 分级分离及收集 1 4 3 cDNABP 重组与电转化大肠杆菌DH108 利 用BPClonase IIenzymemixp 将cDNA 片 段 与pDONR222 质 粒 作BP 重 组 将 重 组 后cDNA pDONR222 载 体 电 转 化DH10B 大 肠 杆 菌 加 入SOC 液 体 培 养 基 于 摇 床 中 复 苏 细 菌45min 复 苏 后 吸 取 50 L 经10 倍 稀 释 后 菌 液 涂 布 于 固 体LB 平 板 用 于 鉴 定 库 容 量 储 存 于 80 冰 箱 中 此 为 初 级 cDNA 文库菌液 1 5 Cf 19 介 导 的 抗 番 茄 叶 霉 病 C fulvum 免 疫 应答酵母双杂交次级 cDNA 文库构建 将 构 建 成 功 的 初 级cDNA 文 库 用 液 体LB 培 养 基 在37 摇 床 上 培 养15h 提 取 质 粒 按 照1 4 3 载 体 构 建 方 法 将 同 浓 度 初 级cDNA 文 库 质 粒cDNA pDONR222 构 建 至 次 级cDNA 文 库 载 体pGADT7 DEST 将 构 建 的 反 应 产 物 按 照 上 述 相 同 方 法 电 转 化 大 肠 杆 菌DH10B 复 苏 菌 液 复 苏 后 菌 液 按 照 1 4 3 方 法 涂 布 固 体LB 培 养 基 平 板 其 余 菌 液 储 存 于 80 冰箱中 此为次级cDNA 文库菌液 1 6 Cf 19 介导的抗番 茄叶霉病免 疫应答酵母 双杂 交各级 cDNA 文库质量鉴定 1 6 1 初级 次级与酵母cDNA 文库库容量鉴定 取1 4 与1 5 转 化 后 酵 母 双 杂 交 初 级cDNA 文 库 与 次 级cDNA 文 库 原 菌 液10 倍 稀 释 分 别 从 初 级cDNA 文 库 与 次 级cDNA 文 库 中 吸 取 菌 液 按 照1 4 3 方 法 涂 布 于 相 应 抗 性 固 体LB 平 板 初 级cDNA 文 库 抗 性 为Kanamycine 次 级cDNA 文 库 抗 性 为Ampicillin 37 培 养 箱 中 培 养16h 长 出 白 色 克 隆 初 级cDNA 次 级cDNA 文 库 滴 度 CFU mL 1 平 板 全 部 克 隆 数 量 50 L 1 100 倍 1 10 3 L 文 库 总 容 量 CFU 文 库 滴 度 CFU mL 1 文 库 菌 液 总 体 积 mL 目 的 酵 母 文 库 滴 度 CFU mL 1 平 板 克 隆 数量 涂板体积 稀释倍数 1 6 2 初 级 次 级 与 酵 母cDNA 文 库 片 段 长 度 与 重 组率鉴定 从 初 级cDNA 文 库 次 级cDNA 文 库 与 酵 母 cDNA 文 库 培 养 基 中 各 随 机 选 择24 个 克 隆 作PCR 检 测 各 级 文 库 重 组 序 列 完 整 性 初 级cDNA 文 库 PCR 引 物M13 与 次 级cDNA 文 库 引 物pGADT7 DEST 均 由Invitrogen 公 司 设 计 提 供 PCR 反 应 程 序 参 考 李 颖 波 等 方 法 9 cDNA 文 库 片 段 长 度 与 重 组 率 经1 琼 脂 凝 胶 电 泳 检 测 鉴 定 重 组 率 重 组成功数量 克隆总数 100 东 北 农 业 大 学 学 报 12 第51 卷a 总RNA 电泳结果 b mRNA 电泳结果 c dscDNA 片段长度 a GelelectrophoretogramresultsoftotalRNA b GelelectrophoretogramresultsofmRNA c dscDNAfragmentlength 图 1 总 RNA mR NA 与 ds cDNA 电泳结果 Fig 1 Gel electrophoretogram results of total RNA mRNA and ds cDNA 2000bp 1000bp 750bp 500bp 250bp 100bp DL2000DNAMarker 2000bp 750bp 500bp 250bp 100bp 1000bp DL2000DNAMarker 28S 18S 1 7 Cf 19 介导 的抗 番茄 叶霉 病免 疫应 答酵 母双 杂 交目的文库构建与质量鉴定 将 次 级cDNA 文 库 菌 液 于 液 体 培 养 基 中 摇 菌 第 二 天 抽 提 质 粒 将 酵 母 文 库 质 粒 转 化Y187 酵 母 菌 株 向 预 冷 离 心 管 中 加 入 次 级cDNA 文 库 质 粒 感 受 态 细 胞 PEG LiAc 溶 液 与DMSO 溶 液 等 试 剂 通 过 冰 浴 水 浴 离 心 等 将cDNA 酵 母 文 库 转 入 酵 母 菌 株 用3YPDPlus 液 体 培 养 基 于30 摇 床 90min 复 苏 酵 母 涂 布 于150mmSD Leu 平 板 上 每 个 平 板 铺 展300 L 共 计100 皿 平 板 30 倒 置 平 板 约72 96h 克 隆 出 现 4 冷 却 平 板3 4h 每 个 平 板 加 入5mL 冷 冻 培 养 基 按 照1 4 3 方 法 取 100 LcDNA 文 库 按 照 1 100 1 1000 和1 10000 稀 释 在SD Trp 平 板 上 在30 培 养 箱 中 培 养48 72h 长 出 克 隆 挑 取 单 克 隆 30 250r min 1 摇 床 培 养16 18h 于10000r min 1 离 心2min 去 除 上 清 液 SDS 重 悬 菌 液 离 心 后 作 菌 落PCR PCR 反 应 程 序 同1 6 2 从 各 管 中 分 别 取5 L 经 琼 脂 糖 凝 胶电泳检测cDNA 文库片段长度与重组率 2 结果与分析 2 1 番 茄 叶 片 总 RNA 提 取 mRNA 纯 化 与 ds cDNA 合成 提 取 被 叶 霉 菌 侵 染 后0 7 和15d 番 茄 叶 片 总 RNA 1 琼 脂 糖 凝 胶 观 察 结 果 见 图1a 主 带 清 晰 无 明 显Smear OD260 OD280 为2 16 OD260 OD280 为 2 17 浓 度 为1 7089 g L 1 表 明RNA 完 整 性 较 好 无 降 解 发 生 可 用 于cDNA 文 库 构 建 由 图1b 可 知 mRNA 凝 胶 电 泳 结 果 显 示mRNA 条 带 为 一 条 均 匀 集 中 的 弥 散 条 带 条 带 分 布 范 围500 2000bp mRNA 质 量 良 好 无 降 解 现 象 dscDNA 经mRNA 反 转 录 的 凝 胶 电 泳 结 果 显 示 见 图1c dscDNA 呈 弥 散性条带 表明dscDNA 分布较完整 2 2 初级 cDNA 文库构建与鉴定 取10 LcDNA 初 级 文 库 原 液 稀 释100 倍 稀 释 后 原 液50 L 涂 布 含Kanamycine 抗 性 固 体 培 养 基 平 板 中 培 养 该 平 板 长 出1800 个 克 隆 见 图2a 按 照cDNA 文 库 滴 度 与 文 库 总 容 量 公 式 计 算cDNA 初 级 文 库 滴 度3 6 10 6 CFU mL 1 cDNA 初 级 文 库 总 容 量1 44 10 7 CFU 为 检 测 该cDNA 初 级 文 库 重 组 序 列 完 整 性 从LB 培 养 基 中 蘸 取24 个 单 克 隆PCR 检 测 由 图2b 可 知 24 个 克 隆 全 部 为 阳 性 克 隆 重 组 率100 可 降 低 试 验 假 阳 性 出 现 概 率 其 中24 个 克 隆 插 入 片 段 长 度500 2000bp 22 个 克 隆 片 段 均 在1000 2000bp 2 个 克 隆 片 段 在500 750bp 插 入 片 段 平 均 长 度 为1000bp 以 上 所 有 数 据 符 合 构建cDNA 初级文库标准 2 3 次级 cDNA 文库构建与鉴定 吸 取50 L 经10 倍 稀 释 的 次 级cDNA 文 库 菌 液 涂 布 于 固 体 培 养 基 平 板 Ampicillin 该 平 板 长 出 克 隆1500 个 见 图3a 计 算cDNA 次 级 文 库 滴 度 3 0 10 6 CFU mL 1 cDNA 次 级 文 库 总 容 量1 2 10 7 CFU 为 检 测 该cDNA 次 级 文 库 重 组 序 列 完 整 性 作 克 隆PCR 检 测 由 图3b 可 知 24 个 克 隆 全 部 为 阳 性 克 隆 重 组 率 仍 为100 表 明 降 低 次 级cDNA 文 库 假 阳 性 出 现 概 率 其 中 全 部 单 克 隆 插 入 片 段 长 度 均 在500 2000bp 23 个 克 隆 片 段 长 度 1000 2000bp 1 个 克 隆 片 段 长 度500 750bp 插 入 片 段 平 均 长 度1000bp 以 上 所 有 数 据 符 合 构 建 cDNA 次级文库标准 许向阳等 Cf 19 介导的抗番茄叶霉 病 Cladosporium fulvum 免疫应答酵母双杂交 cDNA 文库构建和鉴定 第5 期 13 图 3 次级 cDNA 文库容量与重 组率 插入 片段检测 F i g 3 C o l o n y n u m b e r w a s c o u n t e d a n d d e t e c t i o n r e s u l t s o f r e c o m b i n a n t r a t e a n d i n s e r t e d f r a g m e n t s o f s e c o n d a r y c D N A l i b r a r y a 次级cDNA 文库 容量 b 次级cDNA 文库重组率 插入片段检 测结果 a ColonynumberwascountedforsecondarycDNAlibrary b DetectionresultsofrecombinationrateandinsertedfragmentinsecondarycDNAlibrary DL2000DNAMarker a b 2 4 cDNA 文库构建与质量鉴定 次 级cDNA 文 库 菌 液 转 化 酵 母 菌 株 后 涂 布 于 SD Trp 培 养 基 取100 LcDNA 酵 母 文 库 按 照 1 100 1 1000 和1 10000 稀 释 涂 布 并 鉴 定 图 2 初级 cDNA 文库容量与重组率 插入片段检测结果 F i g 2 C o l o n y n u m b e r w a s c o u n t e d a n d d e t e c t i o n r e s u l t s o f r e c o m b i n a n t r a t e a n d i n s e r t e d f r a g m e n t s o f p r i m a r y c D N A l i b r a r y a 初级cDNA 文库 容量 b 初级cDNA 文库重组率 插入 片段检测结果 a ThecolonynumberwascountedforprimarycDNAlibrary b DetectionresultsofrecombinationrateandinsertedfragmentinprimarycDNAlibrary DL2000DNAMarker a b 东 北 农 业 大 学 学 报 14 第51 卷 2000bp 750bp 500bp 250bp 100bp 1000bp 2000bp 750bp 500bp 250bp 100bp 1000bp1 10000 稀 释 度 库 容 量 与 文 库 滴 度 最 终 得 到 cDNA 文 库 酵 母 文 库 平 板 上 有500 个 单 克 隆 见 图 4a 滴 度 为5 0 10 7 CFU mL 1 检 测 构 建 的 酵 母 文 库 完 整 性 由 图4b 可 知 24 个 单 克 隆 全 部 为 阳 性 克 隆 重 组 率100 此 结 果 降 低 酵 母cDNA 文 库 假阳 性出 现概 率 其中 所有 单克 隆插 入片 段长 度均 在500 2000bp 23 个 克 隆 片 段 长 度1000 2000bp 仅1 个 克 隆 片 段 长 度500 750bp 插 入 片 段 平 均 长 度1000bp 以 上 所 有 数 据 均 符 合 构 建 目 的 酵 母 文 库标准 3 讨论与结论 酵 母 双 杂 交 系 统 是 一 种 研 究 蛋 白 质 相 互 作 用 结 构 与 功 能 有 效 的 生 物 技 术 方 法 16 该 技 术 为 构 建 Cf 19 介 导 的 抗 番 茄 叶 霉 病 酵 母 双 杂 交cDNA 文 库 提 供 支 持 cDNA 文 库 质 量 主 要 通 过 两 项 指 标 鉴 定 一 是 库 容 量 另 一 个 是 重 组 序 列 完 整 性 17 库 容 量 指cDNA 文 库 中 所 有 单 独 克 隆 数 量 其 中 文 库 滴 定 浓 度 为1 0 10 6 CFU mL 1 满 足 低 丰 度 mRNA 最 低 筛 选 要 求 18 本 试 验 得 到 初 级 酵 母 cDNA 文 库 滴 定 浓 度 为3 6 10 6 CFU mL 1 次 级 酵 母cDNA 文 库 滴 定 浓 度 为3 0 10 6 CFU mL 1 目 的 酵 母cDNA 文 库 滴 定 浓 度 为5 0 10 7 CFU mL 1 朱 佳 慧 等 构 建 水 稻 幼 苗 酵 母 双 杂 交cDNA 文 库 滴 度 为 4 5 10 7 CFU mL 1 11 王 玉 姣 等 构 建 辣 椒 疫 霉 菌 诱 导 辣 椒 酵 母 双 杂 交cDNA 文 库 滴 度 为1 13 10 6 CFU mL 1 14 相 比 之 下 本 研 究 构 建 Cf 19 介 导 的 抗 番 茄 叶 霉 病 酵 母 双 杂 交cDNA 文 库 基 因 种 类 更 为 丰富 重 组 序 列 完 整 性 通 过 重 组 率 与 插 入 基 因 片 段 长 度 两 项 指 标 评 价 19 插 入 片 段 需 满 足 长 度 各 异 长 度 500bp 与 平 均 插 入 基 因 片 段 1000bp 等 要 求 方 满 足 构 建cDNA 文 库 要 求 cDNA 片 段 越 长 从 文 库 中 获 得 完 整 目 的 基 因 序 列 可 能 性 越 大 20 重 组 率 是 反 映cDNA 片 段 与 初 级 次 级cDNA 文 库 载 体 重 组 效 率 重 要 指 标 本 试 验 中 各 级 文 库 片 段 长 度 均 在 500bp 以 上 平 均 插 入 基 因 片 段 均 达 到1000bp 以 上 各 级 文 库 重 组 率 均 为100 以 上 指 标 均 达 到 构 建cDNA 文 库 标 准 苏 玲 等 构 建 金 柑 花 蕾 酵 母 双 杂 交cDNA 文 库 平 均 插 入 片 段 长 度 大 于1000bp 重 组 率 为97 91 21 李 颖 波 等 构 建 盐 胁 迫 下 大 麦 酵 母 双 杂 交 文 库 平 均 插 入 片 段 长 度 大 于1000bp 重 图 4 cDNA 文库容量与重 组率 插入片 段检测结果 Fig 4 The Colony number was counted and detection results of recombinant rate and inserted fragments of destination cDNA library a 目的文库容量 图 b 目的文库 重组率 插入 片段检测结果 a Colonynumberwascountedfordestinationlibrary b Detectionresultsofrecombinationrateandinsertedfragmentindestinationlibrary DL2000DNAMarker a b 许向阳等 Cf 19 介导的抗番茄叶霉 病 Cladosporium fulvum 免疫应答酵母双杂交 cDNA 文库构建和鉴定 第5 期 15 2000bp 750bp 500bp 250bp 100bp 1000bp组 率 为95 8 9 可 见 本 文 库 重 组 率 极 高 一 定 程 度上降低文库中假阳性出现概率 本 研 究 利 用Gateway 技 术 成 功 构 建 Cf 19 介 导 的 抗 番 茄 叶 霉 病 免 疫 应 答 酵 母 双 杂 交cDNA 文 库 结 果 表 明 初 级cDNA 文 库 滴 度 为3 6 10 6 CFU mL 1 文 库 总 容 量 为1 44 10 7 CFU 次 级cDNA 文 库 滴 度 为 3 0 10 6 CFU mL 1 文 库 总 容 量 为1 2 10 7 CFU Cf 19 介 导 的 抗 番 茄 叶 霉 病 免 疫 应 答 酵 母 双 杂 交 cDNA 文 库 滴 度 为5 0 10 7 CFU mL 1 其 中 各 级 文 库 重 组 率 全 部 高 达100 初 级 次 级 与 目 的 酵 母 文 库 插 入 片 段 长 度 全 部 为500 2000bp 其 中 各 级 文 库 多 数 克 隆 插 入 片 段 均 为1000 2000bp 仅 个 别 为500 750bp 经 计 算 各 级 文 库 插 入 片 段 平 均 长 度 均 为1000bp 以 上 该 文 库 质 量 良 好 可 用 于 互 作 蛋 白 筛 选 分 析 为 探 索 Cf 19 介 导 的 抗 番 茄 叶 霉 病 免 疫 应 答 中 蛋 白 质 互 作 分 子 机 制 奠 定 基 础 参 考 文 献 1 周 勇 番 茄 叶 霉 病 的 发 生 规 律 与 防 治 现 状 J 北 京 农 业 2015 33 62 64 2 刘 冠 赵 婷 婷 李 宁 等 番 茄 与 叶 霉 菌 互 作 机 制 研 究 进 展 J 东 北 农 业 大 学 学 报 2016 47 9 91 99 3 KerrEA BaileyDL Resistanceto Cladosprium fulvumCook obtained from wild species of tomato J Can J Bot 1964 42 1541 1554 4 Hammond Kosack K E Jones J D Incomp