马铃薯早疫病拮抗菌的筛选及其代谢产物的抑菌活性.pdf

马铃薯早疫病拮抗菌的筛选及其代谢产物 的抑菌活性 杨继业 1，2杨 帆 1，2，3崔冠慧 1，2孙劲冲 1，2王雅娜 1，2刘洪伟 1，2程辉彩 1，2张丽萍 1，2* （ 1 河北省科学院生物研究所，河北石家庄 050081； 2 河北省主要农作物病害微生物控制工程技术研究中心， 河北石家庄 050081； 3 河北工业大学，天津300130） 摘 要以马铃薯早疫病病原菌茄链格孢菌（Alternaria solani）为指示菌，通过平板对峙法，筛选出菌株及其发酵滤液对马 铃薯早疫病病原菌均具有较强拮抗作用的生防菌株BAF-6；通过形态特征、生理生化特性鉴定以及16S rDNA序列分析，该 菌株为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）。菌株发酵滤液经60～80 ℃热处理，抑菌活性均在95以上；紫外线照 射8 h或在pH值为2～10的酸碱环境下，发酵滤液的抑菌活性稳定；经蛋白酶处理后抑菌活性仍达50以上。 关键词马铃薯；早疫病；拮抗菌；筛选；鉴定；抑菌活性 土壤养分不足，有机质含量下降，导致植株衰弱， 土传病害增加，如马铃薯早疫病病原菌茄链格孢菌 （Alternaria solani） ，更易侵染衰弱植株的叶片、 茎秆以及块茎，危害严重，是马铃薯的主要病害之 一（郭润婷 等，2016）。 目前国内外对马铃薯早疫病的防治主要通过化 学防治，常用药剂如丙森锌、代森锰锌、霜脲锰锌 等，化学农药虽然方便、快速，但长期使用易造成 生态环境污染严重，菌株抗药性增加，同时农产品 农药残留危害人类健康，因此亟须寻找环境友好型 杨继业，女，硕士，主要从事微生物菌肥研究，E-mail695819348 *通讯作者（Corresponding author）张丽萍，女，研究员，主要从事生 物防治及微生物菌肥研究，E- 收稿日期2017-12-21；接受日期2018-03-20 基金项目河北省科学院科技计划项目（17310） 自我国启动马铃薯主粮化战略，马铃薯栽培 面积随之增加，成为仅次于水稻、小麦、玉米的 第四大粮食作物。与此同时，马铃薯倒茬困难、 连作障碍等问题日益严重（原霁虹，2015） ，使得 the control effect on Fusarium wilt by the of seedling inoculation．The results showed that S1，S4 and S6 treatments could significantly promote watermelon growth．Their inds of plant height，stem diameter，fresh weight above ground，root-crown ratio，strong seedling index，etc．were all higher than that of the contrast． Biological agents had certain control effects on Fusarium wilt of watermelon．Compared with the respective contrast，the disease index of ‘Zaojia 8424’ decreased 76.2-92.8，that of ‘Xinong No.8’ decreased 37.0-54.6． Besides，the disease control effect of these 2 varieties was all outstanding as S6．Further studies found that Bacillus subtilis could significantly inhibit mycelial growth and spore germination of Fusarium oxysporum f. sp. niveum race1．Inhibition rate of mycelial growth reached 67.75 and the conidia germination number was only 24.4 of the contrast．The successive control on pathogenic bacteria could reach 49.3．In summary，S6 has the best combination effect on watermelon growth promotion and control of watermelon Fusarium wilt．And its strain has significant inhibitory effect on growth and spore germination of Fusarium oxysporum f. sp. niveum． Key wordsWatermelon；Biological agent；Fusarium wilt；Growth and development 62 新优品种 栽培管理 本期视点 产业市场 病虫防控 62 研究论文 中 国 蔬 菜 CHINA VEGETABLES 2018（5）62 - 66 生物防治的方法（Wharton et al.，2007；漆文选， 2017） 。王爱军等（2013）筛选出2株萎缩芽孢杆 菌，对马铃薯黑痣病、干腐病病原菌具有较强抑制 作用。姚彦坡（2015）筛选出2株木霉菌株HNA14 和HNA12，对马铃薯晚疫病和辣椒疫病具有较好 的防病效果。 目前芽孢杆菌对马铃薯早疫病的防治研究较 少，因芽孢抗逆性强，具有耐高温、紫外线，易储 存等优点，本试验以马铃薯早疫病病原菌茄链格孢 菌作为指示菌，从河北省科学院生物研究所微生物 实验室保存的生防菌株中筛选对马铃薯早疫病具有 较强抑制效果的芽孢杆菌，对菌株进行生理生化及 16S rDNA鉴定，同时对菌株代谢产物性质进行研 究，以期得到代谢产物抑菌活性稳定的芽孢杆菌， 为进一步研制马铃薯早疫病新型生防制剂奠定前期 基础。 1 材料与方法 1.1 试验材料 供试病原菌为马铃薯早疫病病原菌茄链格孢 菌，由河北农业大学植物保护学院朱杰华教授提 供。供试生防菌株为河北省科学院生物研究所微生 物研究室保藏的600多株生防菌株。 供试培养基PB培养基、NB培养基、PDA培 养基，配制方法参照细菌鉴定手册（布坎南和吉本 斯，1984；东秀珠和蔡妙英，2001）。 1.2 拮抗菌筛选 1.2.1 拮抗菌初筛 取活化好的直径为8 mm的 茄链格孢菌菌饼，点种于PDA培养基（直径90 mm）中央，26 ℃培养2 d，在菌块四周点种生防菌 株，培养4 d后观察菌株抑菌效果。 1.2.2 拮抗菌复筛 将初筛所得拮抗菌经二级摇床 培养后，发酵液12 000 r·min -1 离心10 min去除菌 体，经0.22 μm无菌滤膜过滤得到无菌滤液。吸 取30 mL茄链格孢菌悬浮液（110 6 cfu·mL -1 ）于 300 mL融化的PDA培养基中，混匀后倒入培养皿 中，待培养基凝固后，打孔并点入100 μL上述无 菌滤液，3～4 d后观察抑菌效果。 1.3 菌株鉴定 1.3.1 形态特征及生理生化特性 在PB平板上接 种菌株，32 ℃培养24 h后观察菌株菌落形态，复 红染色后于显微镜镜检。菌株生理生化特性参照伯 杰细菌鉴定手册（布坎南和吉本斯，1984）和常 见细菌系统鉴定手册 （东秀珠和蔡妙英，2001） 进行鉴定。 1.3.2 基因组提取及16S rDNA序列扩增与分 析 采用生工生物工程（上海）股份有限公 司DNA提取试剂盒提取菌株的基因组DNA， 选用16S rDNA基因通用引物进行PCR扩增。 27F5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3，1492R 5-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3。PCR反 应 体 系为50 μLDNA模板2.5 μL，上下游引物各2 μL，2Mix 25 μL，ddH 2 O 18.5 μL。PCR反应程序 94 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 40 s，72 ℃ 90 s，30 个循环；72 ℃ 10 min。PCR产物经1琼脂糖凝胶 电泳检测，并于生工生物工程（上海）股份有限公 司进行测序，将所得序列与GenBank数据库中序列 进行Blast分析比对，并构建系统发育树。 1.4 代谢产物的抑菌活性 1.4.1 热稳定性 将菌株BAF-6的发酵液经0.22 μm无菌过滤器进行除菌，得到发酵滤液，分别在 60、70、80、90、100、121 ℃下热处理30 min，冷 却至室温后，采用打孔法在含有茄链格孢菌的平板 上打孔，并于孔中分别点入100 μL各处理的发酵 滤液，3～4 d后测量各处理抑菌圈的大小，以未经 热处理的发酵滤液为对照，以对照抑菌圈大小为活 性100，计算各处理的相对抑菌活性（杨艳红 等， 2017），每个处理3次重复。 1.4.2 蛋白酶稳定性 分别用质量浓度50 mg·L -1 胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K于37 ℃处理菌株 BAF-6发酵滤液2 h（胡忠亮 等，2017），以未经 蛋白酶处理的发酵滤液为对照，采用1.4.1中的方 法测定并计算各处理的相对抑菌活性，每个处理3 次重复。 1.4.3 紫外稳定性 将菌株BAF-6的发酵滤液放 置在紫外灯下（20 W）20 cm处，分别照射2、4、 6、8 h，以未经紫外灯照射的发酵滤液为对照，采 用1.4.1中的方法测定并计算各处理的相对抑菌活 性，每个处理3次重复。 1.4.4 酸碱稳定性 用1 mol·L -1 盐酸和1 mol·L -1 氢氧化钠溶液分别将菌株BAF-6的发酵滤液pH值 调节为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12，静 63 新优品种 栽培管理 本期视点 产业市场 病虫防控 63 研究论文 中 国 蔬 菜 CHINA VEGETABLES 置12 h后，调节pH至中性，以未经处理的发酵滤 液为对照，采用1.4.1中的方法测定并计算各处理 的相对抑菌活性，每个处理3次重复。 1.5 数据处理 采用MEGA 5.0软件对所筛菌株进行系统发 育树的构建，采用SPSS软件进行数据差异显著性 分析，并用Excel软件进行统计性分析及柱形图的 制作。 2 结果与分析 2.1 拮抗菌筛选结果 通过平板对峙法筛选出对茄链格孢菌有较强抑 制作用的菌株11株，通过测定菌株无菌滤液的抑 菌活性，菌株BAF-6抑菌圈直径较大，为2.4 cm（图 1、2） ，说明菌株及菌株发酵滤液均对病原菌抑制 作用较强。Bacillus subtilis strain H1-7 KR061433.1Bacillus tequilensis strain 10b NR 104919.1Bacillus subtilis strain JCM 1465 NR 113265.1Bacillus subtilis subsp. inaquosorum strain BGSC 3A28 NR 104873.1Bacillus amyloliquefaciens strain Md1-43 MF581449.1BAF-6Bacillus sonorensis strain AF302118Virgibacillus proomii strain 2M HQ992819.1Bacillus alkalidiazotrophicus strain MS 6 EU143680.1Bacillus arsenicus partial AJ606700.1 99 100 99 100 56 65 34 0.005 图 4 菌株 BAF-6的 16S rDNA的系统发育树 图 3 菌株 BAF-6菌体形态 图 1 拮抗菌初筛 图 2 拮抗菌复筛 BAF-6 BAF-6 菌株形态观察及生理生化特性鉴定（表1） ，初步 鉴定该菌株属于芽孢杆菌属（Bacillus）。 2.2.3 菌株BAF-6的分子鉴定 将菌株BAF-6的 16S rDNA序列和NCBI网站中与其基因序列同源性 较高的菌株进行比对，构建系统发育树（图4） ， 结合菌株的形态特征、生理生化鉴定结果以及16S rDNA分子鉴定结果，将菌株BAF-6鉴定为解淀粉 芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）。 2.3 菌株 BAF-6的代谢产物性质 2.3.1 热稳定性 从图5可以看出，60～80 ℃热处 理菌株BAF-6的发酵滤液后，滤液对茄链格孢菌 的相对抑菌活性均与对照无显著差异，抑菌活性均 在95以上。90～121 ℃处理下，发酵滤液的相对 2.2 菌种鉴定 2.2.1 菌株BAF-6的形态特征 菌株BAF-6菌落 呈白色，不透明，近圆形，边缘不规则，菌体杆状， 菌体长约1.8 μm，宽约0.6 μm（图3），产生椭圆 形芽孢，芽孢中生。 2.2.2 菌株BAF-6的生理生化特性 通过2.2.1中 表 1 菌株 BAF-6的生理生化鉴定结果 测定项目 BAF-6 测定项目 BAF-6 革兰氏染色 吲哚试验 - 厌氧生长 酪素分解试验 - 甲基红试验 柠檬酸盐利用 V-P反应 4 ℃条件下生长 酪氨酸水解 - 50 ℃条件下生长 淀粉水解 pH5条件下生长 明胶液化 pH9条件下生长 接触酶反应 注表中阳性反应用“”表示，阴性反应用“-”表示。 64 新优品种 栽培管理 本期视点 产业市场 病虫防控 64 研究论文 中 国 蔬 菜 CHINA VEGETABLES 抑菌活性显著降低，但100 ℃处理下发酵液的相对 抑菌活性仍在85以上，121℃下的相对抑菌活性 在50以上，说明菌株发酵滤液具有较高的热稳 定性。 2.3.2 蛋白酶稳定性 从图6可以看出，采用蛋白 酶K、胃蛋白酶、胰蛋白酶处理菌株BAF-6发酵 滤液后，滤液对茄链格孢菌的相对抑菌活性均显著 降低，但仍在50以上，说明菌株具有抑菌活性 的物质可能不是蛋白质，也可能是蛋白质但不包含 芳香族、脂族氨基酸的羧基肽键，不含赖氨酸、精 氨酸及疏水残基肽键。 2.3.3 紫外稳定性 从图7可以看出，经紫外线照 射后，菌株BAF-6发酵滤液对病原菌的相对抑菌 活性均无显著变化。说明菌株发酵滤液抑菌活性不 因紫外照射而降低，适合于田间应用。 2.3.4 酸碱稳定性 从图8可以看出，菌株BAF-6 发酵滤液在pH值为2～9时的相对抑菌活性与对 照均无显著差异，当pH值为10时，菌株的相对 抑菌活性仍为80以上，说明菌株发酵滤液具有 较高的酸碱稳定性。 图 5 菌株 BAF-6发酵滤液的热稳定性 120 100 80 60 40 20 0 相对抑菌活性／％ 温度／℃ CK 60 70 80 90 100 121 a a a ab b c d 图 8 菌株 BAF-6发酵滤液的酸碱稳定性 120 100 80 60 40 20 0 相对抑菌活性／％ pH值 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 CK aaaaa a aaa b c d 图 7 菌株 BAF-6发酵滤液的紫外稳定性 120 100 80 60 40 20 0 相对抑菌活性／％ 时间／h CK 2 4 6 8 a aa a a 图 6 菌株 BAF-6发酵滤液的蛋白酶稳定性 120 100 80 60 40 20 0 相对抑菌活性／％ 时间／h CK 蛋白酶K 胃蛋白酶 胰蛋白酶 c a b b 3 结论与讨论 利用对病原菌具有拮抗作用的细菌等有益微生 物及其代谢产物进行生物防治是防治农作物病害的 有效方法与技术（邱德文，2010） ，既响应农药减 施及化肥零增长的政策，同时有益于环境、生态和 人类健康。寻找高效生防菌资源，是生物防治途径 中最重要的环节。 目前防治马铃薯早疫病的生物菌剂主要为放线 菌、木霉菌，芽孢杆菌的应用很少。芽孢杆菌可产 生耐热抗逆的芽孢，生存能力强，同时是土壤和植 物微生态区系优势种群，有利于在环境中存活、定 殖和繁殖，因此具备较好的生防特性及开发前景（齐 爱勇 等，2011） 。本试验以马铃薯早疫病病原菌茄 链格孢菌为指示菌，通过平板对峙法筛选到1株对 其具有较强抑制效果的菌株BAF-6，经鉴定该菌株 为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）。 解淀粉芽孢杆菌是植物病害防治中一大类 芽孢杆菌类群，在生长过程中可产生肽类、聚酮 类、脂肽类等具有抗菌活性的代谢产物（Chen et al.，2009）。薛鹏琦等（2011）从解淀粉芽孢杆 菌YBWC43菌株中提取出可抑制油菜菌核病菌的 65 新优品种 栽培管理 本期视点 产业市场 病虫防控 65 研究论文 中 国 蔬 菜 CHINA VEGETABLES 杆菌霉素D和芬枯草菌素。本试验对BAF-6菌株 发酵滤液性质进行研究，结果表明菌株BAF-6发 酵滤液具有较高的热稳定性，且经蛋白酶K、胰蛋 白酶、胃蛋白酶处理后，发酵滤液的相对抑菌活 性仍在50以上，说明抑菌活性物质可能有一部 分并不是蛋白质，需要进一步对有效抑菌物质进行 分离纯化；菌株BAF-6发酵滤液对紫外线照射具 有较强的抗性，在后期菌株田间应用过程中，发酵 滤液中的活性物质可以有效保留；发酵滤液在pH 值2～10时，相对抑菌活性仍在80以上，说明 菌株发酵滤液具有较高的酸碱稳定性。可见菌株 BAF-6具有开发成马铃薯早疫病新型生防制剂的 潜力。 参考文献 布坎南，吉本斯．1984．伯杰细菌鉴定手册．中国科学院微生物 研究所伯杰细菌鉴定手册翻译组译．8版．北京科学出 版社． 东秀珠，蔡妙英．2001．常见细菌系统鉴定手册．北京科学出 版社． 郭润婷，王惟萍，谢学文，李宝聚．2016．马铃薯早疫病的诊断与 防治．中国蔬菜，（11）80-82． 胡忠亮，郑催云，田兴一，李警保，韩正敏，樊奔．2017．解淀粉 芽孢杆菌HZM9菌株发酵液的抑菌谱及稳定性测定．南京林 业大学学报，3（41）65-70． 齐爱勇，赵绪生，刘大群．2011．芽孢杆菌生物防治植物病害研究 现状．中国农学通报，27（12）277-280． 漆文选．2017．高寒山区马铃薯种薯主要病虫害调查与防治方法． 中国蔬菜，（9）93-98． 邱德文．2010．我国植物病害生物防治的现状及发展策略．植物保 护，36（4）15-18． 王爱军，柴兆祥，李金花，郭庆刚，王蒂．2013．马铃薯干腐病菌 和黑痣病菌拮抗芽胞杆菌的筛选及鉴定．中国生物防治学报， 29（4）586-594． 薛鹏琦，刘芳，乔俊卿，伍辉军，冯致科，高学文．2011．油菜菌 核病生防芽孢杆菌的分离鉴定及其脂肽化合物分析．植物保 护学报，38（2）127-132． 杨艳红，余瑛，胡永强，余溪，李青青．2017．解淀粉芽孢杆菌 AF1发酵液的抗菌活性与抗菌机理．生物技术通报，33（9） 233-230． 姚彦坡．2015．防治马铃薯晚疫病和辣椒疫病木霉菌的筛选及生防 机制研究〔博士论文〕．北京中国农业大学． 原霁虹．2015．马铃薯连作障碍的研究进展．中国马铃薯，29（1） 46-50． Chen X H，Koumoutsi A，Scholz R，Borriss R，Schneider K，Vater J，Süssmuth R，Piel J，Borriss R．2009．Genome analysis of Bacillus amyloliquefaciens FZB42 reveals its potential for biocontrol of plant pathogens．Journal of Biotechnology，140（1）27-37． Wharton P S，Kirk W W，Berry D，Tumbalam P．2007．Seed treatment application-timing options for control of Fusarium decay and sprout rot of cut seedpieces．American Journal of Potato Reseach，84（3）237-244． Screening of Antagonistic Bacteria Against Potato Early Blight and Antibacterial Activity of Its Metabolites YANG Ji-ye 1，2 ，YANG Fan 1，2，3 ，CUI Guan-hui 1，2 ，SUN Jin-chong 1，2 ，WANG Ya-na 1，2 ，LIU Hong- wei 1，2 ，CHENG Hui-cai 1，2 ，ZHANG Li-ping 1，2* （ 1 Institute of Biology，Hebei Academy of Science，Shijiazhuang 050081，Hebei，China； 2 Main Crop Disease Microbial Control Engineering Technology Research Center of Hebei Province，Shijiazhuang 050081，Hebei，China； 3 Hebei University of Technology，Tianjin 300130，China） AbstractTaking Alternaria solani as a target，this study screened the biocontrol strain BAF-6 with strong antagonism against pathogenic bacteria of potato early blight by plate confrontation . The strain was identified as Bacillus amyloliquefaciens through morphological，physiological and biochemical tests and 16S rDNA sequence analysis. The extracellular metabolites of the strain after 60-80 ℃ heat treatment，its antibacterial activity was over 95. Under UV irradiation for 8 hours，or when the pH value was 2-10，its antibacterial properties were still stable. After protease treatment the strain antibacterial activity was still over 50. Key wordsPotato；Early blight；Antagonistic bacteria；Screening；Identification；Antibacterial activity 66 新优品种 栽培管理 本期视点 产业市场 病虫防控 66 研究论文 中 国 蔬 菜 CHINA VEGETABLES