外源钙和茉莉酸甲酯诱导番茄植株抗灰霉病研究.pdf

西北植物学报 ，（）： 文章编号 ：（）外源钙和茉莉酸甲酯诱导番茄植株抗灰霉病研究李天来 ，张亢亢 ，余朝阁 ，李琳琳（沈阳农业大学 园艺学院 ，设施园艺省部共建教育部重点实验室 ，辽宁省设施园艺重点实验室 ，沈阳）摘要 ：以 辽园多丽 番茄幼苗为材料 ，研究了经钙 （）、钙螯合剂 （）和茉莉酸甲酯 （）处理后接种番茄灰霉病幼苗叶片的病情指数 、活性氧 （、）含量和过氧化氢酶 （）、超氧化物歧化酶 （）、过氧化物酶 （）活性的变化 。结果显示 ：（）、处理番茄幼苗的灰霉病发病率分别比对照显著降低、和 ，而处理又显著低于 、处理 和 ；处理高于 处理 ，但低于 处理 ；处理低于 处理 。（）、及 处理番茄幼苗叶片中活性氧积累量高于对照 ，处理又高于 、处理 ；但 处理活性氧积累量低于 处理 ，而高于 处理 ；处理的活性氧含量高于 处理 。（）、及 处理幼苗叶片的 、的活性均比对照提高，且以处理最高；而处理抗氧化酶活性低于 处理 ，但高于 处理 ；处理抗氧化酶活性高于 处理 。研究表明 ，钙在茉莉酸甲酯诱导番茄抗灰霉病过程中具有重要调节作用 ，这种作用与钙促进茉莉酸甲酯诱导番茄活性氧积累和抗氧化酶活性有关 。关键词 ：钙 ；茉莉酸甲酯 ；灰霉病 ；番茄 ；诱导抗性中图分类号 ： 文献标志码 ： ， ， ， （ ， ， ， ，）： ， （ ） ， ， ， ：（）， （） ， ， ， （） ， 收稿日期：；修改稿收到日期 ：基金项目 ：国家 “十二五 ”科技支撑计划项目 （）；辽宁省重大科技攻关项目 （）作者简介 ：李天来 （），男 ，博士 ，教授 ，主要从事设施蔬菜栽培与生理研究 。： ， （） ， ， ， ， ：； ； ； 灰霉病是设施番茄生产中最重要的病害之一 ，长期依赖于农药防治 ，极易导致环境和产品污染 ，而诱导抗性为蔬菜病害防治指明一条可持续途径。茉莉酸是一种重要的植物激素 ，它不仅影响植物体的生长和发育 ，而且与抵抗病原侵染有关 ，它可启动植物体内抗病防御基因的表达 ，从而调控植物的防御反应 。现已证明茉莉酸对增强水稻 、番茄 、马铃薯 、甜菜等抗病有积极的作用。近年来研究认为活性氧的积累是植物抗病反应的早期特征之一 ，并参与一系列抗病防卫反应的过程 。在植物与病原物不亲和互作中 ，活性氧快速大量积累 ，而亲和互作中则基本维持不变。病原菌侵染植株而激活信号转导防御途径 ，原生质膜的受体激发子和透过细胞膜的离子流动（、）调节下游反应 ，产生活性氧爆发 （活性氧产物 ）、第二信使茉莉酸 、乙烯和水杨酸的形成。拟南芥中发现胞外及胞内共同参与茉莉酸诱导的钙动员，表明钙信号参与了茉莉酸途径 ，且钙作为胞内第二信使也参与植物抗病防卫反应。虽然迄今钙和茉莉酸分别在植株抗病中的作用研究较多 ，但关于钙在茉莉酸甲酯防御途径中所起的作用和钙与茉莉酸甲酯复合施用对植株的抗病性影响 ，国内外鲜有报道 ，而且钙对茉莉酸甲酯诱导番茄抗病 、活性氧及抗氧化酶系统的影响机制尚不明确 。因此 ，本实验通过钙 、钙螯合剂与茉莉酸甲酯分别及复合施用后接种番茄灰霉病 ，测定番茄叶片活性氧及抗氧化酶等指标 ，探讨钙在茉莉酸甲酯诱导下番茄抗灰霉病途径中的作用 ，并为番茄品种抗病性改良和防治措施制定提供理论依据 。 材料和方法 材料本实验于年月在沈阳农业大学园艺科研基地日光温室内进行 ，供试番茄品种为 辽园多丽 （ ）。供试灰霉菌（ ）由田间分离所得 。病菌培养基为马铃薯 葡 萄 糖 琼 脂 培 养 基 （）。茉 莉 酸 甲 酯（ ）为公司生产 ，钙抑制剂为上海国药生产 。 设计 番茄幼苗培养年月日 ，挑选籽粒饱满 、大小均匀的番茄种子 ，经温水处理后 ，于水温浸种，然后置光照培养箱中催芽 ，选择出芽一致的种子 ，进行穴盘基质育苗 。植株长到片真叶时 ，选择长势一致的植株于塑料钵中进行分苗 。待植株长到片真叶时 ，转至安有空调的拱棚中 ，保证：到：棚内温度。 灰霉病孢子悬浮液的制备将灰霉菌常规方法纯化后 ，接种到培养基上 ，下培养，在超净工作台上将培养基切下放入装有无菌水的锥形瓶中 ，振荡，层纱布过滤 ，镜检调整孢子悬浮浓度为 。 幼苗处理试验共设置 ：茉莉酸甲酯 （）、（）、（）、茉莉酸甲酯（）和茉莉酸甲酯（）等个处理 ，以 蒸 馏 水 为 对 照 （）。其 中 的、浓度分别为、和，每组处理株 。按照实验设计将上述溶液分别均匀喷施于番茄幼苗叶片背面 ，直到滴水为止 。为增强吸收效果 ，在上述溶液中加入的。喷施处理第天喷施灰霉菌孢子悬浮液于植株第、片叶 ，浓度为 ，接菌后内进行遮荫 ，保证湿度在以上 ，第天正常光照 。于接菌后的、取植株第、叶 ，经液氮速冻后置于的冰箱保存 ，用于相关指标的测定 。单株取样 ，次重复 。 测定项目与方法 病情指数接种后调查发病情况 。灰霉病发病程度分级标准为 ：级 ，无病斑 ；级 ，病斑西北植物学报卷面积占叶面积以下 ；级 ，病斑面积占叶面积；级 ，病斑面积占叶面积；级 ，病斑面积占叶面积；级 ，病斑面积 占叶面积以上 。采用分级计数法计算病情指数 。病 情 指 数 （）（各级病叶数各级代表值 ）调查总叶数最高一级代表值 超氧阴离子产生速率和过氧化氢含量叶片超氧阴离子 （）的产生速率采用羟胺氧化法测定，过氧化氢 （）含量采用等的方法测定 。 抗 氧 化 酶 活 性叶 片 超 氧 化 物 歧 化 酶（）活性的测定采用光氧化还原法 ，以抑制光氧化还原的酶量为一个酶活性单位；过氧化氢酶 （）活性的测定采用紫外吸收法 ，以每分钟吸光度减少为一个酶活力单位 ；过氧化物酶 （）活性的测定采用愈创木酚法 ，将每分钟吸光度增加时为一个酶活力单位。 数据处理试验所得数 据 采 用软 件 处 理 ，软件进行单因素方差 （）分析 ， 软件进行绘图 。 结果与分析 不同处理对番茄幼苗病情指数的影响由图可知 ，与相比 ，、处理病情指数分别显著降低、和（），而处理病情指数与对照相比没有显著差异 ；处理病情指数比、单独处理显著下降、，但处理病情指数比单独处理显著升高，低于处理；处理比处理极显著降低。此结果说明和茉莉酸甲酯均能显著诱导降低番茄灰霉病发病率 ，外源钙对茉莉酸甲酯诱导番茄抗灰霉病具有促进作用 ，而缺钙处理则抑制茉莉酸甲酯对番茄抗灰霉病的诱导作用 。 不同处理对番茄叶片活性氧代谢的影响图，显示 ，随着接种时间的延长 ，番茄幼苗叶片的产生速率在、和处理中变化趋势相似 ，均表现为先上升后下降的单峰曲线 ，并均在接种时达到高峰 。而、处理的产生速率均出现个峰值 ，且各处理出现峰值的时间有异 。其中 ，处理产生速率在接种之后迅速上升 ，在达到高峰之后下降 ，产生速率显著高于；处理产生速率在接种和时形成个峰值 ，均显著高于期李天来 ，等 ：外源钙和茉莉酸甲酯诱导番茄植株抗灰霉病研究处理 ，之后产生速率减慢 ；处理产生速率的变化趋势与类似 ，但始终低于处理 。处理产生速率低于处理 。就含量而言 ，除处理产生个峰值外 ，各处理的变化趋势基本相同 ，即均在接种和达到峰值 ，之后逐渐下降 （图，）。其中 ，处 理个 峰 值 的含 量 分 别 高 出、；处理达到峰值的含量分别高出处理、；处理的两个峰值均低于处理 ，但高于处理 。对照组和处理的含量变化是一个动态平衡的过程 ，前期波动上升 ，之后下降 。说明外源钙能够促进了茉莉酸甲酯诱导番茄抗灰霉病信号物质的合成 ，而缺钙处理则抑制了茉莉酸甲酯诱导的合成 。 不同处理对番茄叶片抗氧化性酶的影响图，显示 ，随着接种时间的延续 ，蕃茄幼苗中活性在处理和处理均出现个峰图 不同处理番茄幼苗的 （）、（）、（）活性随接种时间的变化 （），（），（） 值 ，并显著高于，而在其他处理则呈现先逐渐上升后平缓下降的单峰曲线 。处理活性前期明显增加 ，而后呈现动态平衡 ，但始终高于；处理的活性显著高于处理 ，而处理的活性始终低于处理 ，但高于单独处理 。同时 ，各处理番茄幼苗活性的变化趋势与对照相似 ，先升高然后较缓慢地下降 ，、处理均在接种第天达到最大值 ，和处理则在第天达到峰值 ，并且均高于（图，）。各处理活性在接种后变化幅度差异不大 ，其中处理在接种上升之后始终处于较高水平 ，说明其幼苗中能清除过多超氧阴离子 ，有效减轻体内氧化损伤 。番茄幼苗活性在处理中随接种时间的延续逐渐升高 ，于第天时达到峰值 ，之后下降 ；其他处理的活性均在接种第天时达到峰值 ，之后逐渐下降 ，每个处理都高于（图，）。其中 ，处理活性显著高于，在接种第天时是对照活性的倍 ；处理的活性始终高于处理 ，接种第天时约是处理的倍 ；处理的活性始终低于处理 ，高于处理 。可见 ，诱导能茉莉酸甲酯提高番茄幼苗的活性 。 讨论已有研究证实 ，在很多植物系统中和茉莉酸在调控病原菌引起的防御反应中起关键作用。本研究结果表明 ，外源钙能提高茉莉酸甲酯诱导番茄抗灰霉病能力 ，而钙螯合剂抑制茉莉酸甲酯抗灰霉病能力 ，即钙信号途径对茉莉酸甲酯抗灰霉病防御途径有影响 ，这和 等及等研究结果一致 。病原菌或者其他激发子侵入植株后可诱导超氧阴离子 、过氧化氢等活性氧爆发 ，的产生速率增加 ，可以诱导植保素的积累；低浓度可抑制真菌孢子萌发 ，高浓度活性氧对植株有害。在本实验中 ，外源钙能提高茉莉酸甲酯诱导番茄抗灰霉病过程中的产率 ，产生速度快 ，表明处理对灰霉病菌侵染更敏感 ，能较早 、较快地产生；同时 ，外源钙也增加诱导茉莉酸甲酯抗灰霉病过程中的含量 ，可直接作为信号传递过程中的中间体 ，在转录水平和调控植物体内各种防御相关基因的表达。而外源抑制了茉莉西北植物学报卷酸甲酯诱导番茄抗灰霉病活性氧的积累 ，这是因为钙螯合剂影响了防御途径 。抗氧化酶在植株体内相互协调 ，限制病菌侵染 ，从而有效保护细胞膜稳定性和功能 ，增强植株抗病能力 。但、在植株抗病反应中的变化规律说法不一 。一种是酶活性增加与抗病性呈正相关 ，另一种是酶活性与抗病性呈负相关 。本实验中发现 ，抗氧化酶活性与番茄抗灰霉病强弱呈正相关 ，这与前人研究结果一致。是主要的活性氧清除酶类 ，它催化转化为和。经处理的番茄叶片中产生速率高 ，刺激活性增强 ，所以处理活性高于其他处理 ，且长时间保持较高水平 ，导致叶片含量升高 。通过活性提高进而引起含量的增加 ，这是钙诱导茉莉酸甲酯抗番茄灰霉病的机制之一 。虽然活性氧维持在相对较高的水平对植物的抗病性是有益的 ，但过量的活性氧通过脂质过氧化破坏植物细胞 ，所以必须有足够的抗氧剂而使活性氧维持在一个较低水平。和能使转化为和，在活性氧的清除和维持植物体内活性氧的正常水平中起作用 。处理后 ，番茄叶片中、活性上升 ，且处理后番茄叶片、活性比处理显著升高 ，更有利于植株体内活性氧的平衡 ，而钙螯合剂抑制茉莉酸甲酯抗灰霉病途径中抗氧化酶活性 。这说明钙提高了茉莉酸甲酯抗灰霉病途径中抗氧化酶活性 ，减少活性氧爆发对番茄造成的伤害 。综上所述 ，外源钙在茉莉酸甲酯诱导番茄抗灰霉病过程中 ，一方面加快前期活性氧水平的升高 ，升高的活性氧作为信号分子调控植株抗病过程 ；另一方面也影响番茄叶片抗氧化酶系统 ，维持植株体内活性氧的平衡 。外源钙促进茉莉酸甲酯诱导番茄抗灰霉病的原因在于激活了活性氧代谢 ，进而增加抗氧化酶活性 ，具体机理是激活了番茄抗灰霉病的防御途径 ，降低番茄灰霉病发病指数 ，对植株抵御番茄抗灰霉病起到了积极作用 。参考文献 ： ， ， ，： ， ： ， ，： ， ， ， ，（）： （张智慧 ）， （聂燕芳 ）， （何磊 ）， （植物病理学报 ），（）：（ ） （余朝阁 ）， （李天来 ）， （孟庆娟 ）， （沈阳农业大学学报 ），（）：（ ）杨艳丽 外源茉莉酸影响马铃薯对晚疫病抗性的初步研究 长沙 ：湖南农业大学 ，石力伟 茉莉酸处理对甜菜抗丛根病性的作用 呼和浩特 ：内蒙古农业大学 ， ： ，： （宋凤鸣 ）， （郑重 ）， （葛秀春 ） 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