NY T 4491-2025 番茄种子产地检疫规程.pdf

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2025 01 09 发布 2025 05 01 实施 番茄品种鉴定 SNP分子标记法 05 中华人民共和国农业行业标准 备案号 XXXX XXXX 65 020 01 CCS B 4493 2025 Identification of tomatovarieties SNP marker method 中华人民共和国农业农村部 发布 NY T 目 次 前言 范围 规范性引用文件 术语和定义 缩略语 原理 主要仪器设备及试剂 溶液配制 引物信息及使用 参照品种及使用 操作程序 结果判定与表述 附录A 规范性 主要仪器设备及试剂 附录B 规范性 溶液配制 附录C 资料性 引物序列及分型等信息 NY T 前 言 本文件按照GB T 标准化工作导则 第 部分 标准化文件的结构和起草规则 的规定起 草 请注意本文件的某些内容有可能涉及专利 本文件的发布机构不应承担识别这些专利的责任 本文件由农业农村部种业管理司提出 本文件由全国植物新品种测试标准化技术委员会 SAC TC 归口 本文件起草单位 农业农村部科技发展中心 北京通州国际种业科技有限公司 北京市农林科学院蔬 菜研究所 本文件主要起草人 韩瑞玺 王均帅 霍秀爱 张建 马莹雪 刘迎春 刘宝安 张凯淅 张秀杰 王晨宇 温常龙 唐浩 冯艳芳 李嫒嫒 黄芳 王铭堂 刘雪景 庞雪兵 NY T 番茄品种鉴定 SNP分子标记法 范围 本文件规定了利用单核苷酸多态性 SNP 标记进行番茄 SolanumLycopersicumL 品种鉴定的术 语和定义 缩略语 原理 主要仪器设备及试剂 溶液配制 引物信息及使用 参照品种及使用 操作程序 结 果判定与表述 本文件适用于番茄品种DNA分子数据采集和品种鉴定 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款 其中 注日期的引用文件 仅该日期对应的版本适用于本文件 不注日期的引用文件 其最新版本 包括所有的修改单 适用于本文件 GB T 农作物种子检验规程 扦样 GB T 分析实验室用水规格和试验方法 NY T 植物品种鉴定 DNA分子标记法 总则 术语和定义 NY T 界定的术语和定义适用于本文件 缩略语 下列缩略语适用于本文件 CTAB 十六烷基三甲基溴化铵 cetyltrimethylammoniumbromide DNA 脱氧核糖核酸 deoxyribonucleicacid EDTA 乙二胺四乙酸 ethylenediaminetetraaceticacid KASP 竞争性等位基因特异性PCR kompetitiveallelespecificPCR PCR 聚合酶链式反应 polymerasechainreaction SNP 单核苷酸多态性 singlenucleotidepolymorphism Taq酶 耐热DNA聚合酶 Taq DNApolymerase TE 三羟甲基氨基甲烷乙二胺四乙酸 Tris EDTA Tris 三羟甲基氨基甲烷 Tris hydroxymethyl methylaminomethaneTHAM 原理 番茄品种的基因组中存在着能够世代稳定遗传的SNP位点 不同番茄品种在同一SNP位点的序列 可能存在差异 这种差异可通过PCR扩增 测序 高分辨率熔解曲线法 基因芯片等方法进行检测 进而区 分不同的品种 本文件推荐了基于KASP技术的荧光原位扫描检测方法 主要仪器设备及试剂 主要仪器设备及试剂见附录A 溶液配制 除非另有说明 在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和符合GB T 规定的一级水 溶液配制方 法见附录B NY T 引物信息及使用 引物序列及分型等信息见附录C 可利用附录C中的引物序贯检测 当检测到的差异位点数能判定 送检样品与对照样品不同时 停止检测 参照品种及使用 参照品种用于辅助确定送检样品在某个位点的等位变异 宜与送检样品同时检测 操作程序 样品准备 送检样品可为种子 幼苗 叶片等组织或器官 种子样品需扦样时 应符合GB T 的规定 每 份样品不少于 个个体 等量混合分析 必要时进行个体检测 DNA提取 取混合样本约 mg 置于 mL圆底离心管中 经液氮冷冻后充分研磨 每管加入 L预热 到 的CTAB提取液 充分混合 水浴 min min 每隔 min轻缓颠倒混匀一次 每管 加入与CTAB提取液等体积的三氯甲烷和异戊醇混合液 轻缓混匀后静置 min rpm离心 min 吸取上清液转移至新的离心管中 加入等体积预冷的异丙醇 轻轻颠倒混匀 放置 min rpm离心 min 弃上清液 用体积分数为 的乙醇溶液洗涤 遍 晾干 加入 L双蒸水 或TE缓冲液充分溶解 检测DNA浓度和质量 备用 注 以上为推荐的DNA提取方法 DNA质量能够满足PCR扩增要求的其他DNA提取方法均适用于本标准 DNA 溶液的紫外吸光度OD 与OD 的比值宜介于 之间 注 三氯甲烷和异戊醇混合液中三氯甲烷与异戊醇的体积比为 SNP基因分型 PCR扩增 反应体系 PCR反应可以在不同规格的PCR板或膜上进行 反应体系的总体积和各组分体积按照表 进行配 制 设置 个空白对照和 个参照样品 表 基于微孔板或微量反应孔膜平台的PCR反应体系 微孔板类型 微孔板 L 微孔板 L 微量反应孔膜 L DNA模板 ng L PCRMIX 引物工作液 双蒸水 总反应体积 注 微量反应孔膜为DouglasArrayTape平台的反应体系 微孔板的反应体系参照微量反应孔膜配制 反应程序 a min b s s 次循环 c 若初始反应结束检测不到荧光信号 可继续 s s 次 次循环 荧光原位扫描 利用荧光原位扫描系统对PCR扩增产物进行基因分型 空白对照没有扩增信号或者扩增信号较弱 NY T 且参照品种等位变异与附录C的等位变异一致时 采集基因分型数据 数据分析 数据记录 数据记录方式用SNP位点碱基符号表示基因型 如AA TT CC或GG 缺失数据记录为 数 据质量需符合对应检测平台的质控要求 数据比对及差异位点统计 逐一比对送检样品与对照样品每个位点的等位变异数据 按照位点相同 位点差异 数据缺失 无法判 定情形记录每个位点的比对结果 统计检测位点数和差异位点数 结果判定与表述 判定规则 当差异位点数大于 判定为 不同 当差异位点数小于等于 判定为 疑同 结果表述 送检样品与对照样品 或对照样品指纹 采用荧光原位扫描检测 检测位点数为 差异位点数为 判定为 NY T 附 录 A 规范性 主要仪器设备及试剂 A 主要仪器设备 A 高速冷冻离心机 转速不低于 rpm A 微量移液工作站或微量移液器 A 水浴锅或干式恒温金属浴 A 紫外分光光度计 波长定点扫描 nm nm和 nm A 组织研磨仪 A 分析天平 感量为 g A pH计 A 涡旋混合器 A 高压灭菌锅 A PCR扩增仪或水浴PCR扩增装置 A 荧光原位扫描系统 色及以上荧光 A 低温冰箱 A 主要试剂 A 十六烷基三甲基溴化铵 C H CH NBr CAS号 A 三氯甲烷 CHCl CAS号 A 异戊醇 C H O CAS号 A 异丙醇 C H O CAS号 A 乙二胺四乙酸二钠 C H N Na O CAS号 A 三羟甲基氨基甲烷 NH C CH OH CAS号 A 氢氧化钠 NaOH CAS号 A 氯化钠 NaCl CAS号 A 无水乙醇 CH CH OH CAS号 A 盐酸 HCl CAS号 A 巯基乙醇 C H OS CAS号 A 聚乙烯吡咯烷酮 C H NO n CAS号 NY T 附 录 B 规范性 溶液配制 B DNA提取 B mol LEDTA溶液 称取 g乙二胺四乙酸二钠溶于 mL水中 加NaOH调pH至 加水定容至 mL 高压灭菌 min B mol LTris HCl溶液 称取 g三羟甲基氨基甲烷溶于 mL水中 加HCl调pH至 加水定容至 mL 高压灭菌 min B CTAB提取液 分别称取 gCTAB和 g氯化钠和 g聚乙烯吡咯烷酮溶于约 mL水中 加入 mL mol LTris HCl溶液 mL mol LEDTA溶液 加水定容至 mL 高压灭菌 min 冷却后加入 mL 巯基乙醇 摇匀备用 B TE缓冲液 分别量取 mL mol LTris HCl溶液和 mL mol LEDTA溶液 加水定容至 mL 高压灭菌 min B KASP引物工作液 将附录C所示每个位点的三管引物干粉分别用水溶解至 mol L 条上游引物和 条下游通用 引物分别取 L L L混合 再补 L水 最终 条上游引物 条下游通用引物终浓度分别 为 mol L mol L mol L NY T 附 录 C 资 料 性 引 物 序 列 及 分 型 等 信 息 表 C 列 出 了 个 SN P 引 物 序 列 及 分 型 等 信 息 表 C 引 物 序 列 及 分 型 等 信 息 位 点 编 号 引 物 名 称 染 色 体 等 位 变 异 等 位 变 异 参 照 品 种 吉 丽 千 禧 引 物 序 列 侧 翼 序 列 SN P G A GA GG FA M G GG AT TT CA GA GA GA TC AA AA CT TA T HE X GG GA TT TC AG AG AG AT CA AA AC TT AC Co mm on G AA CT TT AT GC CT TC TT CT GT GC TT CT CT TT TA AG AA GC TT CC AT GG AA CT TT AT GC CT TC TT C TG TG CA TC T A G TA AG TT TT GA TC TC TC TG AA AT CC CT GA TT AC AG AT CT CA CA TA CG TA TC SN P T C TC TT FA M T TG AA AG GT GA TT GA GG AA CG HE X TT TG AA AG GT GA TT GA GG AA CA Co mm on C AT TT TA CT CT TC TA TT CG CC TG A CT CC AA AC AC CC AT TT TA CT CT TC TA TT CG CC TG AA TC AC CA CC AG CA GC T C G TT CC TC AA TC AC CT TT CA AA AC CC AT CG GA GA AA CA AC CA AC TC AC AA C SN P A G AA AG FA M A GA TC AA GG TC TC TC AA GG AA GC HE X CA GA TC AA GG TC TC TC AA GG AA GT Co mm on C TT GA CC CA CC AA AA GG AG G TG GT TA GG GA AA GA GG TA CT TG AC CC AC CA AA AG GA GG GA C TC CT TG AC T A G C TT CC TT GA GA GA CC TT GA TC TG AA GC T CA GG AA GA AT CA TT TG CT TC TG SN P A G AG GG FA M C AT AG GA GG GG AC AC CA TA GC HE X CC AT AG GA GG GG AC AC CA TA GT Co mm on T CT CT CG GT CG GT AA AA CC AT AC AG AA CC AA AA TT AA CC GT TC TC TC GG TC GG TA AA AC CA T AC CT GT CA T A G C TA TG GT GT CC CC TC CT AT GG GG GG AT GA TA AA GG GT GG AC AT TA CT TT G SN P G A GA GG FA M C CA CC AA GG AC TA TA AG CA AA AG T HE X CA CC AA GG AC TA TA AG CA AA AG C Co mm on T GG CG AG GA AT CA GT GC A AC CA TT AC AA AC AC AA TT GC TG GC GA GG AA TC AG TG CA CA A AC TG GC TT C A G C TT TT GC TT AT AG TC CT TG GT GG TA GT TA TA TC AT CT TG TT TC TT TG CG G SN P T C TC TC FA M G AG GC AG AG GA GT GG AA AC GC HE X GA GG CA GA GG AG TG GA AA CG T Co mm on G AG CA TT CT TT GC TT CC TT GG CA GC CA AA GA GC AA GC TG AA TC TG CT CA AG AG GA GG CA GA GG A GT GG AA AC G T C AA GT AC GG CA TT GC TG CC AA GG AA G CA AA GA AT GC TC TT GA GA AG GC AG C SN P T C TT CC FA M G AT TG TG GA TT AA GG AA TT TT GG TG C HE X GA TT GT GG AT TA AG GA AT TT TG GT GT Co mm on C CA AT TA TT CC CA TC CA TT TC AA CT AT CG AA GC CA GA AA TT GT GA TT AT TG AT TG TG GA TT AA GG AA TT TT GG TG T C G GA GT TG AA AT GG AT GG GA AT AA TT G GA GG GC CG CT CA GG CT CA GG CT CC NY T 表 C 续 位 点 编 号 引 物 名 称 染 色 体 等 位 变 异 等 位 变 异 参 照 品 种 吉 丽 千 禧 引 物 序 列 侧 翼 序 列 SN P T C TC TT FA M A GC CG CA GA GG TA GT AG TT CC HE X CA GC CG CA GA GG TA GT AG TT CT Co mm on G TT GC CG CT TC TC AT CT CC TC TA TT CC GG TA AG AG AG AT CC GA TG GA TC AG CC GC AG A G GT AG TA GT TC T C G TC GG AG AC TG TG TC AG CG AG GA GT CG AG GG AG AT GA GA AG CG GC AA CG G SN P A G AG AA FA M T TC AA CA CG AA CC TA GT AA TA GT CA TC HE X TT CA AC AC GA AC CT AG TA AT AG TC AT T Co mm on C AG CA GA TG CT CA TC GG AC T GA AG AA AG CA GA GC GA TG GA TC AC GC AG CA GA TG CT CA TC G GA CT GA TT T A G A TG AC TA TT AC TA GG TT CG TG TT GA AT GA AC AG AG TA AA TA CC CT GA AT C SN P A G GG AA FA M C GT GA GG TG AA GG AA CC TC TG HE X TC GT GA GG TG AA GG AA CC TC TA Co mm on T CA GC TT GA GT GG TG AT GG C TT CG GG TG TA TC CT CT AG CT AA GA CG GA TC GT GA GG TG AA G GA AC CT CT A G TT CC AA AT GT CC CA AG CC AT CA CC AC T CA AG CT GA AA AC AT TA CG GC AC A SN P C G CG CC FA M G GA TC CA TT CA TT CA TC AC AT TA TA G HE X GG AT CC AT TC AT TC AT CA CA TT AT AC Co mm on C TT AA GA TG TT CA CA AA GA CT AA AT GG CA CA AA CT TA TA GA TA TC AT AT AA GG AT CC AT 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C TC TC FA M A TC GT CT GG AT TA AG GC TA AG G HE X AA TC GT CT GG AT TA AG GC TA AG A Co mm on G GG CT AT CA AG TG TT AT CA GA GA G GC TC GA GT AG CT GT CG AC TC TC AG AG GG CT AT CA AG TG TT A TC AG AG AG C T C C TT AG CC TT AA TC CA GA CG AT TC AA TT GC TG GG GA AG CA GT TT GT GA TA T SN P T G TG TT FA M A TG CC GA AT AT AC TT CC TA TT AC G HE X AC AT GC CG AA TA TA CT TC CT AT TA CT Co mm on G GT CC AT GT CA TC AT TT TA TC CT A CT AG TC TA GA TC CG TT TC TA CA TG TG TA CT AA AT TA CA TG C CG AA TA TA CT TC CT AT TA C T G TG TA GG AT AA AA TG AT GA CA TG GA CC AT GA CA AA GC TC AT CT TT AT GT CA AA AA CA T TT G NY T 表 C 续 位 点 编 号 引 物 名 称 染 色 体 等 位 变 异 等 位 变 异 参 照 品 种 吉 丽 千 禧 引 物 序 列 侧 翼 序 列 SN P C G GG CG FA M C GG TC GA GT TC GG AG AC AT AC HE X CG GT CG AG TT CG GA GA CA TA G Co mm on A GG TT TC TC TT TC TC CG TC CC GG TG AA GG TT TC TC TT TC TC CG TC CC TT CC CG CG CT GC CG CT AA CC AA CT C G T AT GT CT CC GA AC TC GA CC GC AT TG TT CT CA AA GA CA AA TC AT CG GC TC G SN P A G AA AA FA M T GA GT AA AA CA TC GA CT TT TG CG HE X TG AG TA AA AC AT CG AC TT TT GC A Co mm on G CA GC AA TG CT AA AG GA AA TC GT AG TT GT TG TT GT TG TT GG AG AG CC TT TG AG TA AA AC AT C GA CT TT TG C A G TA TT CT TC TC TT TC AT GT TT GA TT TC CT TT AG CA TT GC TG CA AC AT CT TT SN P T C TC CC FA M T CG CA AT TT AG CA CT TG GT AA G HE X TC GC AA TT TA GC AC TT GG TA AA Co mm on C TT GG GT AT GC AC CT TT TC G AA AA AC CC AT AC CC AT CT GA AT TA CT CA AC TT GG GT AT GC A CC TT TT CG G T C T TA CC AA GT GC TA AA TT GC GA TA TG AG TA AG GA GT AC TA CC AA AA CC GG G SN P A G GG GG FA M G TG GA GA AA TC TT TT GC AC CC HE X TG TG GA GA AA TC TT TT GC AC CT Co mm on T AC TT CC CC CT CC CA CG TT TC TG GT GG CT TC CC AT TA CT TC CC CC TC CC AC GT TA TC AG GA AA AC TC TT A G GG TG CA AA AG AT TT CT CC AC AA CC AC T TC TT CT TC AT TC TC TT GT AA CA A SN P A G GG AA FA M T GT AG GG AT TA CT CT CT GT AT GG AA C HE X TG TA GG GA TT AC TC TC TG TA TG GA AT Co mm on C CC TG GG AA GT CT TT CA AT GT TG AT 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AC TT CA AA TT TT GT TA GT GT AG AT TT AT CG AG GG A A C GC TA GA TT TG TA TT GA GT TG TG GC AT TA AA TT TT AG AA GA AC AC AT GA TC NY T 表 C 续 位 点 编 号 引 物 名 称 染 色 体 等 位 变 异 等 位 变 异 参 照 品 种 吉 丽 千 禧 引 物 序 列 侧 翼 序 列 SN P G A GG GG FA M C AG CT AA CC AA CC CC TA TG TC A HE X AG CT AA CC AA CC CC TA TG TC G Co mm on A GT TT TA AC GG TA TT CT TA TT GT GT GA AT TT CC TC AG AA TG AC TT CA TG TT GT TC CA GC TA AC CA AC CC CT AT GT C G A A TC AT TC AC AC AA TA A GA AT AC CG TT AA AA CT TT AA AG TT CA AG GA TA GC SN P A G GG AG FA M T TC CA CA AA AC CA CC AT CA AC HE X TT CC AC AA AA CC AC CA TC AA T Co mm on C TA CA AG AC TA TT AA TC AT GT TT TC CT C TT AT AA TC AG TG TA CC CT AC AA GA CT AT TA AT CA TG TT TT CC TC TT TT T A G T TG AT GG TG GT TT TG T GG AA TA AC TT AG TA TT GA CA TT CC TT GG CT AA GA 注 吉 丽 和 千 禧 在 个 SN P 位 点 的 等 位 变 异 信 息 作 为 核 对 每 批 基 因 分 型 数 据 质 量 的 参 照 样 品 注 等 位 变 异 为 与 HE X 荧 光 对 应 的 变 异 等 位 变 异 为 与 FA M 荧 光 对 应 的 变 异 每 个 点 对 应 条 引 物 分 别 为 与 FA M 荧 光 H EX 荧 光 对 应 的 引 物 以 及 共 用 引 物 采 用 其 他 荧 光 标 记 类 型
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