甲基营养型芽胞杆菌NKG-1对番茄灰霉病的防治效果及全基因组分析.pdf

40 3 679 689 中国生物防治学报 Chinese Journal of Biological Control 2024 年 6 月 收稿日期 2023 08 04 基金项目 国家自然科学青 年基金 32202385 临沂大学博士科研启动项目 LYDX2020BS032 临沂大学大学生创新创业训练计划项目 X202210452276 作者简介 张丝雨 女 本科生 E mail 2237381657 通信作者 博士 讲师 E mail liubinghua12345 DOI 10 16409 ki 2095 039x 2024 02 024 甲基营养型芽胞杆菌 NKG 1对番茄灰霉病的防治效果 及全基因组分析 张丝雨 高文静 张丙翠 杨 吉 刘焕珊 刘炳花 临沂大学农林科学学院 临沂 276000 摘要 为了研究甲基营养型芽胞杆菌 NKG 1 对番茄灰霉病的防治效果 采用 NKG 1 发酵液处理番茄灰霉 菌 观察番茄灰霉菌菌丝生长状态 测定菌丝干重 抑菌率 调查其对番茄离体叶片 苗期灰霉病防治效 果 结果显示甲基营养型芽胞杆菌 NKG 1 显著抑制番茄灰霉菌菌丝的生长和产孢 对番茄离体叶片灰霉 病防治效果达 80 00 对苗期番茄灰霉病的防治效果达 73 14 通过对 NKG 1 全基因组进行分析预测 发现该菌含有 12 个次级代谢产物基因簇 其中脂肽类抗生素表面活性素和丰原素具有抑菌作用 且丰原 素已被证实具有强烈的抗真菌活性 本研究为甲基营养型芽胞杆菌 NKG 1 防治番茄灰霉病的应用和解析 防病机理提供了重要的理论基础 关 键 词 甲基营养型芽胞杆菌 番茄灰霉病 全基因组 NKG 1 中图分类号 S476 文献标识码 A 文章编号 1005 9261 2024 03 0679 11 Control Effect of Bacillus methylotrophicus NKG 1 on Tomato Gray and Its Genome Wide Analysis ZHANG Siyu GAO Wenjing ZHANG Bingcui YANG Ji LIU Huanshan LIU Binghua College of Agriculture and Forestry Linyi University Linyi 276000 China Abstract To investigate control effect of Bacillus methylotrophicus NKG 1 on tomato gray mold dry weight of B cinerea and inhibition rate and control efficacy of NKG 1 on tomato gray mold were investigated after treatment with the fermentation broth of NKG 1 The results showed that NKG 1 significantly inhibited the hyphae growth and spore production of B cinerea The control efficacy of NKG 1 against gray mold on tomato leaves in vitro was 80 00 and that on tomato plant at seedling stage was 73 14 By analyzing and predicting the whole genome of NKG 1 it was found that the NKG 1contained 12 secondary metabolite gene clusters Among them lipopeptide antibiotics surfactant and fengycin have antibacterial effects Fengycin has been proved to have strong antifungal activity The above results provide an important theoretical basis for application of B methylotrophicus NKG 1 to control tomato gray mold and are helpful to analyze the biological control mechanism of B methylotrophicus NKG 1 Key words Bacillus methylotrophicus tomato gray mold whole genome NKG 1 番茄灰霉病是由灰葡萄孢菌 Botrytis cinerea 引起的一种常见的真菌性病害 其病原菌不仅侵染番茄叶 片和茎秆造成叶片病斑和茎部腐烂 而且还会侵染果实导致番茄果实腐烂 1 在我国番茄种植已成为蔬菜 产业的重要组成部分 番茄灰霉病在全国番茄种植区均有发生 一旦发病后传播速度极快 对番茄产量和 680 中 国 生 物 防 治 学 报 第 40 卷 品质都会产生极大的影响 通常会造成番茄减产 20 50 严重时可达 60 以上甚至会导致绝产 2 番 茄灰霉病的防治通常以化学防治为主 但由于灰霉菌具有繁殖速度快 遗传变异大和适合度高的特性 传 统化学杀菌剂的大量使用不仅会诱发灰霉菌的耐药性还会造成残留问题 对生态环境和人类健康都造成了 极大地危害 3 4 近年来 国家和人们对食品安全和生态环境越来越重视 对无公害 绿色 有机果蔬的需 求也大幅增加 这使得对人畜无害 自然环境污染小 不易产生抗药性的生物农药逐渐成为预防 治疗和 控制番茄灰霉病和其他植物病虫害重要而有效的途径 5 然而当前我国生物农药市场占有率不足 10 无 论是种类还是数量都无法满足农业生产需求 因此开发和推广应用新的生物农药产品迫在眉睫 6 目前 市面上作为灰霉病杀菌剂的生物农药的活性成分微生物有 枯草芽胞杆菌 Bacillus subtilis 解 淀粉芽胞杆菌 Bacillus amyloliquefaciens 巨大芽胞杆菌 Bacillus megatherium 荧光假单胞菌 Pseudomonas fluorescens 哈茨木霉菌 Trichoderma harzianum 等 芽胞杆菌类杀菌剂是防治灰霉病的主要生防产品 7 10 贝莱斯芽胞杆菌 Bacillus velezensis 5YN8 能够显著防治番茄灰霉病 11 贝莱斯芽胞杆菌 WZ 37 的发酵粗 提液对番茄灰霉病的防治效果到达 68 5 12 枯草芽胞杆菌 HMB19198 发酵液对番茄灰霉病的防治效果达 到 70 20 接近于化学农药的防效 13 李凤硕 14 研究结果表明 枯草芽胞杆菌和解淀粉芽胞杆菌其混菌 组合为 1 2 时喷施番茄植株 发现番茄植株超氧化物歧化酶和氧化物酶的含量均显著提高 番茄植株对灰 霉病的抗病能力增强 发病率显著降低 利用芽胞杆菌防治植物病害虽然取得了一定的进展 但目前许多 具有生防潜力的芽胞杆菌在实际生产应用中存在不稳定 见效慢的情况 原因之一与芽胞杆菌生防机制不 明确有关 15 为真正解决芽胞杆菌在植物病害防治中的稳定性和高效性问题 对芽胞杆菌防治植物病害的 作用机制研究就必不可少 16 目前关于芽胞杆菌的防病机理主要集中在抗生作用 诱导抗病性 空间和营养竞争 定殖 溶菌作 用等方面 其中抗生作用被认为是最主要的防病机理 17 抗生作用是芽胞杆菌作为生防菌防治植物真菌病 害的重要机制之一 芽胞杆菌可通过产生脂肽类抗生素 水解酶等多种胞外代谢物质导致植物病原真菌菌 丝畸形 菌丝端破裂 原生质浓缩以及抑制孢子萌发 18 已有大量研究发现 芽胞杆菌抗真菌活性主要归 因于非核糖体合成途径产生的脂肽类抗生素 19 20 抗细菌活性主要归因于非核糖体合成途径产生的脂肽类 抗生素和核糖体合成途径产生的细菌素 21 非核糖体合成途径产生的脂肽类抗生素在芽胞杆菌在防治植物 真菌病害中起到关键作用 22 甲基营养型芽胞杆菌 Bacillus methylotrophicus NKG 1 是由中国农业科学院植物保护研究所从采自长 白山土壤样品中分离获得的一株具有广谱抑菌活性和对植物具有显著促生作用的生防菌株 23 24 本研究通 过测定甲基营养型芽胞杆菌 NKG 1 对番茄灰霉菌的抑菌率 生物量和生长形态的影响以及苗期番茄灰霉 病的防治试验来说明其对番茄灰霉病的防治效果 通过对甲基营养型芽胞杆菌 NKG 1 全基因组进行分析 预测 初步探究了其防病机制 本研究将有助于解析甲基营养型芽胞杆菌 NKG 1 的生防机制 为下一步 在实际生产中应用甲基营养型芽胞杆菌 NKG 1 防治番茄灰霉病提供理论基础 1 材料与方法 1 1 试验材料 1 1 1 供试菌株 甲基营养型芽胞杆菌 NKG 1 番茄灰霉菌 B05 10 均由中国农业科学院植物保护研究 所农用抗生素课题组提供 1 1 2 供试种子 番茄种子为中蔬四号 1 1 3 培养基 LB 液体培养基 胰蛋白胨 10 g 酵母提取物 5 g NaCl 10 g 蒸馏水定容至 1000 mL 分 装至三角瓶 121 灭菌 30 min 用于芽胞杆菌 NKG 1 的培养 PDA 培养基 马铃薯 200 g 煮沸 30 min 后过滤留滤液加入葡萄糖 20 g 琼脂 15 20 g 蒸馏水定容至 1000 mL 分装三角瓶 121 灭菌 30 min 用于番茄灰霉菌的培养 1 2 菌株和番茄苗的培养 1 2 1 芽胞杆菌无菌发酵液的制备 将甲基营养型芽孢杆菌 NKG 1 菌液按体积比 2 的比例接种至 LB 培 养基 28 220 r min 的条件下振荡培养约 48 h 至菌液浓度达到 1 10 8 cfu mL 将培养好的菌液离心取 第 3 期 张丝雨等 甲基营养型芽胞杆菌 NKG 1 对番茄灰霉病的防治效果及全基因组分析 681 上清后用直径为 0 22 m 的滤膜过滤 得到 NKG 1 的无菌发酵液 1 2 2 番茄灰霉菌的培养 采用直径为 5 mm 的打孔器将番茄灰霉菌制成菌饼 将菌饼置于 PDA 培养基平 板中央 23 培养至番茄灰霉菌均产孢并且菌丝铺满整个培养基平板 1 2 3 番茄苗的种植 采用温汤浸种的方法处理番茄种子 冷却至室温后 将种子均匀地放置于培养皿中 28 的恒温进行催芽 将已萌发的番茄种子种植于营养土 蛭石和珍珠岩 3 1 1 的塑料花盆中 将种植的 番茄苗置于温室培养 生长环境条件如下 温度为 25 20 光 暗 相对湿度控制在 70 左右 光周 期为 18 h 6 h 光 暗 1 3 不同浓度甲基营养型芽胞杆菌 NKG 1 发酵液对番茄灰霉菌的抑制效果 在 PDA 培养基中添加甲基营养型芽胞杆菌 NKG 1 无菌发酵液 其浓度分别为体积比 0 5 1 2 5 10 以不添加芽胞杆菌发酵液的 PDA 培养基作为对照 在 PDA 培养基平板中央接种直径为 5 mm 的番茄灰霉菌 置于培养箱中培养 待对照组灰霉菌长满平板后 观察各个试验组灰霉菌的生长情况 试 验重复 3 次 测量每组番茄灰霉菌生长直径 计算 NKG 1 发酵液对番茄灰霉菌生长的抑制率 抑制率 对照菌组落直径 处理组菌落直径 对照菌落直径 100 1 4 不同浓度甲基营养型芽胞杆菌 NKG 1 发酵液对番茄灰霉菌菌丝生长的影响 配置不含琼脂的液体 PDA 培养基 将 NKG 1 发酵液按 0 5 1 5 10 的体积比添加至液体 PDA 培养基中 不添加发酵液的培养基作为对照 在液体培养基中接种直径为 5 mm 的番茄灰霉菌菌饼 置于 摇床中 在 23 120 r min 的条件下震荡培养 5 d 将培养 5 d 的番茄灰霉菌经滤纸过滤后放入烘箱 90 烘至恒重 试验重复 3 次 称量各组番茄灰霉菌的菌丝干重 1 5 不同浓度甲基营养型芽胞杆菌 NKG 1 发酵液对番茄灰霉菌菌丝形态的影响 在 PDA培养基中添加体积比为 1 的芽胞杆菌 NKG 1发酵液 以不添加芽胞杆菌 NKG 1发酵液的 PDA 培养基作为对照 在 PDA 培养基平板中央接种直径为 5 mm 的番茄灰霉菌 置于培养箱中培养 待对照组 灰霉菌产孢且菌丝长满平板后 取适量未经处理的番茄灰霉菌和含有 1 的甲基营养型芽胞杆菌 NKG 1 发 酵液的培养基培养的番茄灰霉菌菌丝制成临时玻片 置于放大相同倍数 10 10 显微镜下 观察菌丝形 态及产孢结构的形态 1 6 不同浓度甲基营养型芽胞杆菌 NKG 1 发酵液对番茄灰霉病的防治效果 1 6 1 离体叶片试验 摘取大小 规格和生长发育状况一致的番茄叶片 放入载有滤纸片的干净培养皿中 在叶片中央放置直径为 5 mm 的番茄灰霉菌菌饼 24 h 后将稀释 5 倍 10 倍 20 倍的芽胞杆菌 NKG 1 的 无菌发酵液均匀喷施于试验组的叶片 直至叶片全部润湿 同时用相同体积的无菌水喷施对照组番茄叶片 待试验进行到第 4 d 时统计各组叶片的发病率和防治效果 1 6 2 番茄植株试验 当番茄植株幼苗长到 4 叶 1 心时 将在 PDA 固体培养基上培养 5 7 d 的番茄灰霉菌 孢子用无菌水从培养基上洗脱过滤 6000 r min 离心 5 min 倒掉上清液 收集灰霉菌孢子 采用 2 浓度 的蔗糖溶液重悬浮孢子使其浓度为 2 10 5 cfu mL 将番茄灰霉菌孢子悬浮液均匀地喷施番茄植株的叶片和 茎部 喷至叶片湿润 接种后保持光照培养箱中的空气相对湿度在 90 以上 喷施灰霉菌孢子悬浮液 24 h 后 将稀释 5 倍 10 倍 20 倍的芽胞杆菌 NKG 1 的发酵液均匀喷施于试验组的叶片和茎部 直至叶片全 部润湿 同时用相同体积的无菌水喷施对照组的番茄植株 试验重复 3 次 待植株发病后 分级调查各组 的发病情况 番茄灰霉病叶片分级标准 0 级为无病斑 1 级病斑面积占整个叶面积 5 以下 3 级病斑面 积占整个叶面积 6 10 5 级病斑面积占整个叶面积 11 20 7 级病斑面积占整个叶面积 21 50 9 级病斑面积占整个叶面积 50 以上 25 计算发病率 病叶率 病情指数和防治效果 病叶率 病 叶数 总叶数 100 病情指数 各级病叶数 相对级数值 调查总叶数 最高级代表值 100 发病率 发病植株数 总植株数 100 防治效果 对照组病情指数 处理组病情指数 对照病情指数 100 1 7 甲基营养型芽胞杆菌 NKG 1 全基因组分析及基因功能注释 提取甲基营养型芽胞杆菌 NKG 1 全基因组 DNA 进行三代测序 使用 SMRT portal 软件对 reads 进行 组装和比对 统计 map 到最长序列的测序深度分布情况 将得到的初步组装结果进行比对分析 筛分染色 682 中 国 生 物 防 治 学 报 第 40 卷 体 并将染色体序列组装成为一个线性基因组序列 即最终获得 0 gap 完整图序列 将预测得到的基因序 列与 COG Cluster of Orthologous Groups of proteins KEGG Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes 等数据库做 BLAST 比对 得到基因功能注释结果 1 8 分析预测甲基营养型芽胞杆菌 NKG 1 次级代谢基因簇 利用次级代谢分析软件 anti SMASH ThioFinder 等数据库对甲基营养型芽胞杆菌 NKG 1 全基因组序 列进行分析 结合 StreptomeDB ClusterMine360 DoBISCUIT 等数据库 预测甲基营养型芽胞杆菌 NKG 1 全基因组中次级代谢基因簇类型 位置及对应产物 2 结果与分析 2 1 不同浓度甲基营养型芽胞杆菌 NKG 1 发酵液对番茄灰霉菌的抑制效果 在 PDA 培养基上接种的番茄灰霉菌培养 5 d 时 对照组灰霉菌直径到达 9 cm 添加 NKG 1 发酵液体 积比为 0 5 1 2 的培养基上灰霉菌的平均生长直径分别为 1 67 1 37 1 30 cm 其抑菌率分别为 81 48 84 48 和 85 56 表 1 培养基中添加 NKG 1 发酵液体积比为 5 10 的番茄灰霉菌均为 0 50 cm 抑菌率 94 44 图 1 表 1 不同浓度甲基营养型芽胞杆菌 NKG 1 发酵液对灰霉菌抑菌率 Table 1 Bacteriostatic rate of different concentrations of B methylotrophicus NKG 1 fermentation broth on B cinerea NKG 1 浓度 Concentration of NKG 1 菌落直径 Colony diameter cm 抑菌率 Inhibition rate CK 9 00 0 00 a 0 00 0 5 1 67 0 12 b 81 48 1 12 c 1 1 37 0 15 c 84 81 1 07 b 2 1 30 0 10 c 85 56 1 26 b 5 0 50 0 00 d 94 44 0 00 a 10 0 50 0 00 d 94 44 0 00 a 注 表中数据为平均数 标准差 不同小写字母表示同列数据在 0 05 差异显著水平 Note Data were presented as mean SD data with different lowercase letters indicated significant difference at 0 05 level A 0 5 NKG 1 发酵液 Fermentation broth B 1 NKG 1 发酵液 Fermentation broth C 2 NKG 1 发酵液 Fermentation broth D 5 NKG 1 发 酵液 Fermentation broth E 10 NKG 1 发酵液 Fermentation broth 图 1 不同浓度甲基营养型芽胞杆菌 NKG 1 发酵液对番茄灰霉菌的抑制效果 Fig 1 Inhibition effect of different concentrations of B methylotrophicus NKG 1 fermentation broth on B cinerea 2 2 不同浓度甲基营养型芽胞杆菌 NKG 1 发酵液对番茄灰霉菌生物量的影响 番茄灰霉菌在液体 PDA 培养基中培养 5 d 后菌丝体平均干重达到 1 09 g 而在培养基中添加不同浓度 的 NKG 1 发酵液后菌丝体干重显著降低 添加体积比为 0 5 1 2 和 5 的 NKG 1 发酵液后番茄灰 霉菌菌丝体平均干重分别为 0 53 0 36 0 17 和 0 02 g 图 2 结果表明 甲基营养型芽胞杆菌 NKG 1 可以显著抑制番茄灰霉菌菌丝的生长 2 3 甲基营养型芽胞杆菌 NKG 1 发酵液对番茄灰霉菌菌丝形态的影响 显微镜下观察菌丝的生长和产孢状况结果显示 为未经处理的番茄灰霉菌 菌丝体粗壮 颜色为深灰 色或黑色 其产孢结构子实体饱满 有些正在释放黑色孢子 图 3A B 1 NKG 1 发酵液处理后的菌 丝体纤细 颜色变浅为灰色或褐色 产孢结构子实体瘦小且不产生黑色的孢子 图 3C D 甲基营养型 芽胞杆菌 NKG 1 抑制菌丝的生长 影响菌丝的形态和产孢 第 3 期 张丝雨等 甲基营养型芽胞杆菌 NKG 1 对番茄灰霉病的防治效果及全基因组分析 683 灰霉菌菌丝干重 The dry weigh t o f B cin e r e a g 图 2 不同浓度甲基营养型芽胞杆菌 NKG 1 菌液处理番茄灰霉菌菌丝干重 Fig 2 The effect of B methylotrophicus NKG 1 fermentation broth on hyphae dry weight of B cinerea A 未处理的番茄灰霉菌菌丝状态 Hyphae morphology of untreated B cinerea B 未处理的番茄灰霉菌子实体 Fruiting body of untreated B cinerea C 1 NKG 1 发酵液处理后的菌丝状态 Hyphae morphology of 1 NKG 1 fermentation broth treated B cinerea D 1 NKG 1 发酵液处理后的子实体 Fruiting body of 1 NKG 1 fermentation broth treated B cinerea 图 3 甲基营养型芽胞杆菌 NKG 1 发酵液对番茄灰霉菌菌丝形态的影响 Fig 3 The effect of B methylotrophicus NKG 1 fermentation broth on hyphae morphology of B cinerea 2 4 不同浓度甲基营养型芽胞杆菌 NKG 1 发酵液对番茄灰霉病的防治效果 2 4 1 离体叶片试验 接种番茄叶片后未喷施 NKG 1 发酵液的离体叶片全部发病 发病率达 100 并且 叶片黄化严重 而喷施 NKG 1 发酵液后的离体叶片发病率显著降低 叶片只有发病部位颜色发生变化 图 4 喷施稀释 5 倍 10 倍和 20 倍的 NKG 1 发酵液的离体叶片发病明显减轻 防治效果分别为 80 00 66 67 53 33 表 2 表 2 不同浓度甲基营养型芽胞杆菌 NKG 1 发酵液对番茄离体叶片灰霉病防治效果 Table 2 The effect of B methylotrophicus NKG 1 fermentation broth on tomato gray mold of tomato leaves in vitro NKG 1 浓度 Concentration of NKG 1 发病率 Incidence rate 防治效果 Control effect CK 100 00 0 00 a 0 00 5 20 00 0 00 d 80 00 0 00 a 10 33 33 3 28 c 66 67 2 33 b 20 46 66 2 61 b 53 33 3 32 c 注 表中数据为平均数 标准差 不同小写字母表示同列数据在 0 05 差异显著水平 Note Data were presented as mean SD data with different lowercase letters indicated significant difference at 0 05 level 684 中 国 生 物 防 治 学 报 第 40 卷 A 无菌水对照 Sterile water control B 喷施稀释 5 倍的 NKG 1 发酵液 Spray NKG 1 broth diluted 5 times C 喷施稀释 10 倍的 NKG 1 发酵液 Spray NKG 1 broth diluted 10 times D 喷施稀释 20 倍的 NKG 1 发酵液 Spray NKG 1 broth diluted 20 times 图 4 不同浓度甲基营养型芽胞杆菌 NKG 1 发酵液对番茄离体叶片灰霉病防治效果 Fig 4 The effect of different concentration of B methylotrophicus NKG 1 fermentation broth on tomato gray mold 2 4 2 番茄植株试验 喷施稀释 5 倍 10 倍和 20 倍的 NKG 1 发酵液的番茄病叶率 病情指数和发病率均 显著低于喷施无菌水的对照组 病情指数分别为 8 23 12 47 和 17 23 其防治效果分别达到 73 14 59 27 和 43 73 表 3 结果表明 甲基营养型芽胞杆菌 NKG 1 发酵液对番茄灰霉病具有显著的防治 效果 图 5 表 3 不同浓度甲基营养型芽胞杆菌 NKG 1 对番茄灰霉病的防治效果 Table 3 Effect of different concentration of B methylotrophicus NKG 1 fermentation broth on tomato gray mold NKG 1 浓度 Concentration of NKG 1 病叶率 Rate of diseased leaves 病情指数 Disease index 发病率 Incidence rate 防治效果 Control effect CK 49 03 0 64 a 30 71 0 47 a 56 83 0 43 a 0 00 5 22 22 0 40 d 8 23 0 20 d 27 45 0 20 d 73 14 0 30 a 10 25 44 026 c 12 47 0 30 c 34 69 0 25 c 59 27 0 20 b 20 33 93 0 20 b 17 23 0 50 b 44 06 0 61 b 43 73 0 32 c 注 表中数据为平均数 标准差 不同小写字母表示同列数据在 0 05 差异显著水平 Note Data were presented as mean SD data with different lowercase letters indicated significant difference at 0 05 level A 无菌水对照 Sterile water control B 喷施稀释 5 倍的 NKG 1 发酵液 Spray NKG 1 broth diluted 5 times C 喷施稀释 10 倍的 NKG 1 发酵液 Spray NKG 1 broth diluted 10 times D 喷施稀释 20 倍的 NKG 1 发酵液 Spray NKG 1 broth diluted 20 times 图 5 不同浓度甲基营养型芽胞杆菌 NKG 1 发酵液对番茄灰霉病防治效果 Fig 5 Effect of different concentration of B methylotrophicus NKG 1 fermentation broth on tomato gray mold 第 3 期 张丝雨等 甲基营养型芽胞杆菌 NKG 1 对番茄灰霉病的防治效果及全基因组分析 685 2 5 甲基营养型芽胞杆菌 NKG 1 全基因组测序结果 甲基营养型芽胞杆菌 NKG 1 全基因组长 4197217 bp GC 含量为 47 06 结合 NR COG KEGG 以 及 GO 数据库对全基因组进行基因功能注释 结果显示全基因组共预测到 4432 个开放阅读框 占整个基 因组长度的 89 77 对编码基因 重复序列 非编码 RNA 等进行预测 获取测序 NKG 1 基因组的组成 情况 基因组共编码 87 个 tRNA 总长度 6706 bp 9 个 5s rRNA 总长度 1035 bp 9 个 16s rRNA 总 长度 13842 bp 9 个 23s rRNA 总长度 26352 bp 和 10 个 sRNA 总长度 1147 bp NKG 1 全基因组 序列已提交至 GenBank No CP024203 图 6 图 6 甲基营养型芽胞杆菌 NKG 1 全基因组图谱 Fig 6 The Whole genome map of B methylotrophicus NKG 1 2 6 甲基营养型芽胞杆菌 NKG 1 基因注释结果 使用 BLAST 软件 把菌株 NKG 1 的蛋白编码基因 与 COG 数据库进行比对 将菌株的基因和其相 对应的功能注释信息结合起来 得到注释结果如图 7 所示 共有 3448 个基因被注释 其中有 320 个基因 功能未知 参与氨基酸转运和代谢的基因最多 达到有 306 个 其次有 303 个基因与转录相关 图 7 值得注意的是有 101 个基因功能被注释为防御机制 111 个基因功能被注释为次级代谢生物合成 运输和 分解代谢的功能 这些基因可能参与菌株 NKG 1 抑菌功能 使用 BLAST 软件 把菌株 NKG 1 的氨基酸序列 与 KEGG 数据库进行比对 把甲基营养型芽胞杆 菌 NKG 1 的基因和其相对应的功能注释信息结合起来 得到注释结果如图 8 共有 25 条 KEGG 注释路径 涉及 1204 个基因 其中碳水化合物代谢和氨基酸代谢途径是参与基因数量最多的两条途径涉及的基因分 别有 203 和 118 个 分析结果还显示有 22 个基因被注释为萜类和大环内酯类代谢途径 10 个基因被注释 为其他次级代谢产物生物合成途径 这两条途径中的基因可能参与菌株 NKG 1 抑菌功能 686 中 国 生 物 防 治 学 报 第 40 卷 图 7 COG 注释结果 Fig 7 Annotation result of COG 图 8 KEGG 通路注释结果 Fig 8 Annotation result of KEGG pathway 2 7 甲基营养型芽胞杆菌 NKG 1 次级代谢基因簇预测结果 利用 anti SMASH ThioFinder 等数据库对芽胞杆菌 NKG 1 全基因组序列进行分析 分析得到全基因 组共包含 12 个次级代谢基因簇 基因簇种类包括 大环内酯类 非核糖体肽类 细菌素类 萜烯类等 第 3 期 张丝雨等 甲基营养型芽胞杆菌 NKG 1 对番茄灰霉病的防治效果及全基因组分析 687 具体次级代谢基因簇的碱基位 基因簇类型及预测化合物见表 4 其中 8 个基因簇预测到相应的化合物 分别是表面活性素 surfactin butirosinA butirosinB 大环内酯类抗生素 macrolactin H 大环内酯类 抗生素 bacillaene 丰原素 fengycin 地非西丁 difficidin 儿茶酚型嗜铁素 bacillibactin 溶 杆菌素 bacilysin 其中脂肽类抗生素表面活性素和丰原素在芽胞杆菌与抑菌防病相关次级代谢产物中 最为常见 据报道丰原素具有强烈的抑真菌活性 其对褐斑病 灰霉病和炭疽病等真菌病害具有很好的防 治作用 26 表 4 甲基营养型芽胞杆菌 NKG 1 次级代谢产物基因簇预测结果 Table 4 Prediction of B methylotrophicus NKG 1 secondary metabolite gene clusters 序号 ID 在基因组中位置 Position in genome 基因簇类型 Gene cluster type 预测化合物 Putative compound 预测化合物类型 Type of putative compound 1 291188 320921 Thiopeptide 硫肽类 NPR 脂肽类 2 331742 396605 Nrps 非核糖体肽 surfactin 表面活性素 糖类 3 963112 1004356 PKS like 类聚酮和酶 butirosinA butirosinB 4 1089979 1107213 Terpene 萜烯类 5 1487288 1574183 transAT PKS transAT 型聚酮和酶 macrolactin H 大环内酯类 6 1797163 1906776 transAT 型聚酮和酶 T3 型聚酮和酶 NRPS 非核糖体肽 bacillaene 大环内酯类 非核糖体肽 7 1972923 2107496 NRPS 非核糖体肽 transAT 型聚酮和酶 fengycin 丰原素 非核糖体肽 8 2177203 2199086 Terpene 萜烯类 9 2282662 2323762 T3PKS T3 型聚酮和酶 10 2439346 2545526 transAT 型聚酮和酶类 transAT 型聚酮和酶 difficidin 地非西丁 大环内酯类 非核糖体肽 11 3263855 3315645 NRPS 非核糖体肽 bacteriocin 细菌素 bacillibactin 儿茶酚型嗜铁素 非核糖体肽 12 3849337 3890755 Other 其他 bacilysin 溶杆菌素 其它 3 讨论 自 2015 年农业农村部开展化肥农药使用量零增长行动 提出持续推进农药减量增效 继续保持农药 使用量负增长 倡导建立资源节约型和环境友好型的生态文明和绿色生产 27 芽胞杆菌作为生物农药目前 在农业生产中已有广泛使用 大量的实践应用证明其不仅可以直接作用于作物防病促生 还可以通过对土 壤进行修复 改善土壤微生物环境 增加土壤肥力 从而减少作物病虫害的发生 提高作物产量 28 本研 究所选用的甲基营养型芽胞杆菌 NKG 1 能够有效抑制番茄灰霉菌菌丝生长和产孢进而防治番茄灰霉病 对番茄苗上的灰霉病防治效果达到 73 14 接近化学农药的氟菌 肟菌酯 1000 倍液 13 对番茄灰霉病的防 治效果 通过抑菌试验结果显示 NKG 1 发酵液显著抑制番茄灰霉菌菌丝生长并且影响菌丝形态和孢子的 产生 甲基营养型芽胞杆菌 NKG 1 通过抑制菌丝生长和产孢对番茄灰霉病具有很好的防治效果 具有良 好的开发潜力和应用前景 甲基营养型芽胞杆菌 NKG 1 全基因组经测序分析显示该菌含有 12 个次级代谢产物基因簇 基因簇种 类包括 大环内酯类 非核糖体肽类 细菌素类 萜烯类等 表面活性素 伊枯草素和丰原素是最为常见的 脂肽类抗生素 目前对这三类抗生素的研究主要集中在枯草芽胞杆菌和解淀粉芽胞杆菌而在甲基营养型芽胞 杆菌中相关报道较少 29 表面活性素的抗菌机制与其强大的表面活性相关 它可以插入脂质双层膜中 溶解 液体磷脂相 使膜溶解从而改变膜的通透性 具有很强的抗细菌和病毒活性 对但真菌抑制作用较弱 30 枯 草芽胞杆菌 RB14 和 6051 产生的表面活性素分别能够控制立枯丝核菌和荧光假单胞杆菌 31 32 丰原素具有 强烈的抗真菌活性和较弱的抗细菌和病毒活性 目前研究发现丰原素对褐斑病 灰霉病和炭疽病等真菌病 害具有显著的抑菌活性 但是表面活性素对真菌病害没有显著的抑菌活性 26 33 本研究下一步计划从丰原 688 中 国 生 物 防 治 学 报 第 40 卷 素的角度深入开展甲基营养型芽胞杆菌 NKG 1 对番茄灰霉菌的防病机理 为以后在农业实际生产中应用 甲基营养型芽胞杆菌 NKG 1 防治番茄灰霉病提供理论基础 参 考 文 献 1 李宝聚 陈立芹 孟伟军 等 湿度调控对番茄灰霉病菌侵染的影响 J 植物病理学报 2003 33 2 167 169 2 杨利敏 仝赞华 郭立华 等 番茄灰霉生防菌 CQ 的分子鉴定及其生防效果研究 J 中国生物防治学报 2015 31 6 956 960 3 姚士桐 陆志杰 金周浩 等 春季大棚番茄灰霉病发生规律及影响因子分析 J 中国农学通报 2011 27 10 194 198 4 卜元卿 孔源 智勇 等 化学农药对环境的污染及其防控对策建议 J 中国农业科技导报 2014 16 2 19 25 5 王秋颖 粉红粘帚霉引发的番茄抗灰霉病的抗病信号传导通路分析 D 哈尔滨 东北农业大学 2019 6 周蒙 中国生物农药发展的现实挑战与对策分析 J 中国生物防治学报 2021 37 1 184 192 7 Compant S Duffy B Nowak J et al Use of plant growth promoting bacteria for biocontr