黄瓜枯萎病拮抗放线菌的筛选及防治效果.pdf

李培谦 药 震 邵元元 等 黄瓜枯萎病拮抗放线菌的筛选及防治效果 江苏农业科学 黄瓜枯萎病拮抗放线菌的筛选及防治效果 李培谦 药 震 邵元元 冯宝珍 北部湾环境演变与资源利用教育部重点实验室 广西地表过程与智能模拟重点实验室 南宁师范大学 广西南宁 运城学院生命科学系 山西运城 摘要 为筛选黄瓜枯萎病生防菌 采集黄瓜根际土壤分离放线菌 通过对峙培养获得一株具有较强抑菌活性的放 线菌 根据形态特征 生理生化特性及 序列系统进化分析确定菌株 为卡那链霉菌 发酵液具有强烈的抑菌活性 其 倍稀释液对黄瓜枯萎病菌分生孢子萌发及菌 丝生长抑制率分别达到 其 倍稀释液对孢子和菌丝抑制率也在 以上 黄瓜苗盆栽防效试 验结果显示 菌株 发酵液对黄瓜枯萎病防效可达 放线菌 对黄瓜枯萎病菌具有较好的抑菌活 性 具有开发成天然抗菌活性物质的潜力 关键词 黄瓜枯萎病菌 链霉菌 抑菌活性 生物防治 中图分类号 文献标志码 文章编号 收稿日期 基金项目 国家自然科学基金 编号 北部湾环境演变与 资源利用教育部重点实验室和广西地表过程与智能模拟重点实验 室 南宁师范大学 开放基金 编号 山西省高校科技创新项目 编号 山西省自然科学基金 编号 运城科技局项目 编 号 运城学院食品科学与工程 重点学科项目 编号 作者简介 李培谦 男 山东济南人 博士 副教授 主要从事 生物防治研究 通信作者 冯宝珍 博士 教授 主要从事果蔬病害防治研究 黄瓜真菌性枯萎病 是黄 瓜生产上的毁灭性病害之一 该病害由尖孢镰刀菌黄 瓜专化型 引 起 该病害在世界黄瓜种植区广泛发生 给黄瓜生 产造成严重损失 该病的化学防治常以多菌灵 咪鲜胺 恶霉灵 代森锰锌等杀菌剂为主 但高频 次 大剂量使用化学药剂给生态环境带来巨大压 力 农药残留和环境安全已经成了危害人类健康的 棘手问题 因而 从环保生态角度研究广谱高效 的生防菌对枯萎病防治具有不可替代的作用 近年来报道的对黄瓜枯萎病具有拮抗作用的 微生物有真菌 细菌 和放线菌 棘孢 木霉 哈茨木霉 和拟康氏木霉 联合接 种对黄瓜枯萎病防效可达 而深绿木霉 的水分散粒剂效果优于哈茨木霉 葡萄汁有孢汉逊酵母 菌株 在固体培养基上对黄瓜枯萎病病菌具有完 全抑制作用 芽孢杆菌中巨大芽孢杆菌 多粘 类芽孢杆菌 枯草芽孢杆菌 解淀粉芽孢杆 菌 和贝莱斯芽孢杆菌 等均对黄瓜枯萎病菌具 有抑制作用 而放线菌中对黄瓜枯萎病具有良好 抑制效果的生防菌以链霉菌属 居多 如黄赭色链霉菌 菌株对黄瓜枯萎 病防效为 比基尼链霉菌 菌株对黄瓜枯萎病菌具有明显的抑制效 果 对黄瓜枯萎病菌抑制率达到 龟裂链霉菌 菌株发酵 产物黄瓜枯萎病菌的拮抗作用明显 然而 放线 菌资源丰富 种类繁多 已研究报道的种类有限 而 且 由于目前使用的一些化合物的高残留性以及病原 物出现的抗药性 所以挖掘新抗生素和其他生物活性 代谢物仍然是新药研究的重要目标 本研究以农业生产上难以防治的黄瓜枯萎病 菌为靶标 进行拮抗放线菌筛选 并对高活性菌株 进行发酵复筛 种类鉴定 室内及离体防效研究 本研究旨在为黄瓜枯萎病生物防治提供理论依据 也为拮抗生防菌资源开发奠定基础 江苏农业科学 年第 卷第 期 材料与方法 供试材料 试验于 年 月至 年 月在运城学 院逸夫实验楼及智能温室开展 年 月于山 西省运城市北相镇黄瓜大棚采集土壤样品 采用五 点取样法在健康黄瓜根际取土 取 土样 装入无菌自封袋备用 供试病原菌黄瓜枯萎病菌 保存于笔者所在 实验室 高氏一号培养基 可溶性 淀粉 蒸馏水 马铃薯葡萄糖 培养 基 马铃薯 葡萄糖 琼脂粉 蒸馏水 小米培养基 葡萄糖 蛋白胨 小麦 蒸馏水 值 放线菌的分离与纯化 将风干土样研磨成粉 称取 倒入 无 菌水中 搅拌溶解后静置 取上清液 将上清 液梯度稀释后与 左右高氏一号培养基混匀后 倒平板 置于 培养箱培养 周 长出菌落后转 接到新的高氏一号平板 具体方法参见文献 拮抗放线菌的筛选 拮抗菌株的初筛 根据参见文献 的方 法 准备放线菌和黄瓜枯萎病菌菌饼 将黄瓜枯萎 病菌菌饼接种于 平板中央 同时将放线菌菌饼 接种于距病原菌约 的四周 培养 对照组只接黄瓜枯萎病菌菌饼 观察病原菌菌落 生长情况 并测量菌落直径 每个处理重复 次 放线菌发酵液活性测定 放线菌 用 高氏一号液体培养基于 振荡培养 然后再按 的接种量接入到装液量为 的 小米培养基中 三角瓶 在 上述培养条件下发酵 发酵结束后 用快速定性 滤纸抽滤得到发酵液 所得发酵液再用 的 无菌滤器过滤 置于 冰箱备用 采用滤纸条法和牛津杯法检测发酵液的抑菌 活性 滤纸条法 平板正中接病原菌菌饼 然 后在菌饼两侧同等距离处贴滤纸条 然后加入 发酵液浸润 以无菌水作为对照 试验重复 次 牛津杯法 制备 个 黄瓜枯萎病分 生孢子悬浮液 将 孢子悬浮液均匀涂布在 平板上 然后将 个无菌牛津杯均匀放置在 平板上 将 发酵滤液置于牛津杯中 以 无菌水为对照 将平板置于 下恒温培养 然 后测量抑菌圈宽度 每个处理设置 个重复 拮抗菌株的分类地位 表型特征及生理生化特征 在高氏一号培 养基上培养 观察气生菌丝 基内菌丝颜色 可溶性色素的有无 根据文献描述的方法对菌株进 行初步鉴定 采用插片法观察菌株 在高 氏一号培养基的基内菌丝形态和孢子特征 菌株 生理生化特性分析参照 放线菌快速鉴定与系统分 类 和 微生物资源学 中相应章节的描述 进行 分子鉴定 利用十六烷基三甲基溴化铵 法提取 基因组 以细菌 通用引物 和 进行 扩增 反应体系 基因组 引物各 补足至 反应程序为 个循环 最后 扩增产物经电泳初步检测后 送到生工生物工 程 上海 股份有限公司进行测序 测序结果在 中进行 分析比对 并下载模式菌株的 序列 采用 构建 系统发育树以明确菌株分类地位 对黄瓜枯萎病的拮抗活性及防效测定 发酵液对黄瓜枯萎病菌丝生长的影响 培养箱内将黄瓜枯萎病病菌在 平板上培 养 周 用打孔器取菌饼 直径 将无菌发 酵原液与 培养基按一定比例混匀制成含药平 板 使发酵液稀释成 倍液 将菌饼 接至平板中央 下培养 后 以十字交叉法 测量菌落直径大小 计算菌丝生长抑制率 菌丝生 长速率计算公式参照文献 进行 以无菌水的 处理为对照 设置 个重复 发酵液对黄瓜枯萎病病菌分生孢子萌发的 影响 制备浓度为 个 的黄瓜枯萎病 孢子悬浮液 加入适量上述发酵液将孢子悬浮液终 浓度调为 个 于 暗培养 后 镜检 每个处理观察 个视野 分别观察 个分生 孢子 统计孢子萌发率 如果分生孢子抽出芽管 江苏农业科学 年第 卷第 期 芽管长度至少为分生孢子长度的一半 长出菌 丝 则判定分生孢子已萌发 以无菌水为对照 每个处理 个重复 参照文献中方法计算孢子萌 发率 发酵液对盆栽黄瓜苗的防治效果 利用盆栽黄瓜苗测定 对黄瓜苗期枯萎病的 室内防效 按上述方法制备黄瓜枯萎病病菌孢子 悬浮液 个 接种感病黄瓜品种 的幼 苗 试验设置 个处理 接种病原菌 发酵液原液 接种病原菌分生孢子悬浮液 每个 处理使病原菌分生孢子终浓度调节为 分别移栽 棵黄瓜幼苗并用 接种液灌根处 理 具体测试方法参见文献 试验设置 个 重复 后测量并记录发病情况 计算病情指 数和防治效果 病情指数 病株数 相应级 数 总株数 最高级数 防治效果 对照病 情指数 处理病情指数 对照病情指数 数据处理 采用 统计分析软件对测量数据进行 差异显著性检验 新复极差法 结果与分析 拮抗菌株分离 共获得 株放线菌纯培养 编号为 通过形态观察 初步去除重复菌株 根据 平板对峙培养结果 发现对黄瓜枯萎病具有明显拮 抗作用的放线菌有 株 表 其中菌株 抑 菌率达 因此本研究选择 进行后续 试验 图 表 放线菌对黄瓜枯萎病菌的抑制作用初筛结果 菌株编号菌落直径 抑菌率 注 同列数据后不同小写字母表示在 水平上差异显著 表 表 同 拮抗放线菌复筛 对拮抗放线菌进行复筛 结果表明 发酵液抑 菌活性显著 牛津杯周围出现了明显的抑菌圈 抑 菌圈直径可达 图 浸润发酵液的无 菌滤纸条具有明显的抑制活性 而对照组病原菌能 正常生长 图 图 因此 放线菌 发酵液具有明显的抑菌活性 可以作为黄瓜枯萎病 候选生防菌用于后续试验 菌株鉴定 形态特征 放线菌 在高氏一号培养 基上菌落呈扁平状 近圆形 孢子丝乳白色 培养过 程中无色素产生 图 其基丝连续 气生菌丝发 达 可产生大量孢子 生理生化特征 根据 放线菌快速鉴定与 系统分类 和 微生物资源学 的相关章节方法对菌 株生理生化进行分析 由表 可知 菌株 能使淀粉 纤维素水解 能使牛奶凝固和胨 化 能使明胶液化 不能使硝酸盐还原 不能产生硫 化氢 能利用 葡萄糖 果糖 蔗糖 不能利 用麦芽糖 鼠李糖 分子鉴定 对放线菌株 进行分子鉴 定 结果表明 放线菌株 的 核苷酸 总长为 登录号 经 比对分析 发现与菌株 同源性高者均 属于链霉菌属 下载 个典型菌株的 序 列用 软件 法构建进化 江苏农业科学 年第 卷第 期 表 菌株 的生理生化特征 生理生化特征结果生理生化特征结果 淀粉水解 纤维素利用 硫化氢反应 牛奶胨化 硝酸盐还原 明胶液化 牛奶凝固 麦芽糖 蔗糖 果糖 鼠李糖 葡萄糖 注 表示阳性反应或可利用 表示阴性反应或不可 利用 树 图 结果表明 菌株 与 亲缘关系最近 聚为一 支 因此将菌株 初步鉴定为卡那链霉菌 放线菌 对黄瓜枯萎病的抑菌活性及盆 栽防效 发酵滤液对黄瓜枯萎病分生孢子萌发的抑 制作用 经不同浓度发酵滤液处理的黄瓜枯萎病 分生孢子萌发率差异明显 说明 发酵滤液对 黄瓜枯萎病菌分生孢子萌发具有明显的抑制效果 稀释 倍的发酵液处理的黄瓜枯萎病菌孢子萌发抑 制率达 当发酵液稀释 倍时对分生孢 子的抑制率为 稀释 倍时 对病原菌分 生孢子萌发抑制率仍达 而当稀释到 倍时 抑制效果明显减弱 分生孢子萌发抑制率只 有 抑菌活性显著降低 表 江苏农业科学 年第 卷第 期 发酵液对黄瓜枯萎病菌生长的抑制效果 由表 可知 发酵液对黄瓜枯萎病菌菌丝生 长抑制效果明显 当发酵液稀释 倍时 对病原菌 菌丝生长抑制率为 当稀释 倍时 抑制 率为 当稀释 倍时 菌丝抑制率下降到 当稀释 倍时 菌丝抑制率为 抑菌活性显著降低 表 菌株 发酵滤液对黄瓜枯萎病菌菌丝生长的抑制作用 稀释倍数分生孢子萌发抑制率 菌丝生长抑制率 发酵液对黄瓜枯萎病的防效 将 菌 株发酵后进行黄瓜枯萎病盆栽防效测定 结果 表 表明 接种菌株 发酵原液有效降低了黄瓜 枯萎病的发病 发病率明显降低 防治效果达 发酵液拮抗黄瓜幼苗枯萎病效果 明显 具有生防菌株的潜力 具有良好的应用前景 讨论与结论 真菌性枯萎病是农业生产上重要的土传病害 主要由镰孢菌属真菌尖孢镰孢菌 引起 据报道大田作物 园林花 卉 林果及保护地蔬菜等均能发生真菌枯萎病 造 成严重损失 枯萎病病原菌生存能力强 传播途径 表 菌株 发酵滤液对盆栽黄瓜苗防病效果 处理 病害防治 发病率 病情指数防病效果 黄瓜枯萎病菌 发酵原 液 病原菌 多 一旦发病很难根治 因此 近年来利用高活性 生防菌防治枯萎病是治理该类病害的重要途径 筛选高防效拮抗微生物菌株是生防制剂开发的重 要基础 本研究从黄瓜根际土壤中分离到一株对黄 瓜枯萎病菌具有强烈拮抗作用的菌株 该菌 株对黄瓜枯萎病菌菌丝生长和孢子萌发的抑制作 用明显 目前国内外枯萎病拮抗放线菌以链霉菌 属生防菌报道居多 对黄瓜枯萎病菌具有明显的抑制效果 菌株 能抑制黄瓜枯萎病菌 而且对尖镰孢菌黏团专化型 有抑制作用 对苦 瓜枯萎病具有良好的抑制作用 对香蕉枯萎病有较好的抑制作用 这些 研究均表明链霉菌具有控制土传病害的巨大潜力 据报道 卡那链霉菌对苜蓿炭疽病菌及粉红镰孢 尖镰孢等苜蓿根腐病菌均表现出良好的拮抗效 果 本研究将菌株 初步鉴定为卡那链霉菌 该研究首次报道了用于枯萎病防治的卡那链霉菌 链霉菌应用于生物防治主要是利用活体竞争 作用 诱导或提高植物抗病性和代谢产物抑菌作 江苏农业科学 年第 卷第 期 用 本研究中滤纸条和牛津杯试验结果均能证 明 发酵液对黄瓜枯萎病菌拮抗效果显著 本研究中共同接种黄瓜枯萎病菌与放线菌时比单 一接种病原菌组的黄瓜苗发病率降低了 百分 点 温室条件下 发酵液对黄瓜苗期枯萎病 的防效达到 表明放线菌 对病原菌 的生防作用是由于发酵活性物质 据报道 放线菌 菌株 发酵液对黄瓜枯萎病防效达 杀结节链霉菌 的代谢 产物对稻瘟病的抑菌作用 都与本研究结果相 似 而链霉菌菌株 菌悬液对盆栽和大田苦瓜枯 萎病菌的防效和促生作用明显 说明放线菌具有 抑菌促生作用 而影响放线菌抗菌活性物质产生 的关键因素是发酵条件 因此优化发酵条件是提高 活性成分含量的必经途径 本试验通过小 米培养基发酵 后续研究将通过单因素和正交试验 优化发酵条件 以确定最佳发酵条件 提高活性成 分含量 再者 生防菌能否在植物根部定殖也是决 定大田试验效果的重要因素 本研究下一步将通 过荧光蛋白标记技术确定其定殖特性 本研究未 确定该放线菌的抑菌活性物质 后续将通过层析技 术 色谱技术等确定活性物质的成分及结构 参考文献 张春秋 马光恕 廉 华 等 木霉对黄瓜幼苗生理特性及枯萎病 防治效果的影响 植物保护 朱森林 王丹媚 唐秀梅 等 木霉水分散粒剂的培养条件优化及 其对黄瓜枯萎病的防治效果 浙江农业学报 张俊杰 尚益民 田 寅 等 株黄瓜枯萎病菌拮抗酵母的分离 鉴定及其拮抗作用初探 河南农业大学学报 季倩茹 陈 静 胡远亮 等 种芽孢杆菌菌剂对黄瓜枯萎病的 防效及其作用机制初探 华中农业大学学报 张德珍 李婷婷 代惠洁 等 解淀粉芽孢杆菌 对黄瓜的防 病促生作用 北方园艺 罗文建 杨 凡 史宣杰 等 黄瓜枯萎病拮抗菌的分离鉴定及其 生物防效 华中农业大学学报 张涛涛 张 虹 赵 娟 等 黄赭色链霉菌 发酵工艺及其对 黄瓜幼苗生长的影响 科学技术与工程 圆 圆 张 虹 苏道拉呼 等 抑制黄瓜枯萎病的链霉菌 及其生防作用研究 中国生物防治学报 路丹丹 赵艳芳 马 正 等 龟裂链霉菌 抗真菌物质的 分离鉴定及其在黄瓜枯萎病防治中的应用 中国生物防治 学报 中国科学院微生物研究所放线菌分类组 链霉菌鉴定手册 北京 科学出版社 李培谦 冯宝珍 李新秀 等 番茄灰霉菌拮抗放线菌 的 筛选及鉴定 应用生态学报 徐丽华 娄 恺 张 华 等 微生物资源学 北京 科学出 版社 叶振风 吴湘琴 吕冠华 等 梨树腐烂病的病原菌鉴定和化学 药剂筛选 华中农业大学学报 李培谦 冯宝珍 尖孢镰孢菌果胶裂解酶基因家族鉴定及侵染 表达模式分析 微生物学通报 李晓芳 田叶韩 彭海莹 等 防治苦瓜枯萎病的拮抗放线菌分 离筛选及鉴定 应用生态学报 江苏农业科学 年第 卷第 期 胡进玲 汪治刚 徐 娜 等 防治紫花苜蓿真菌病害的生防菌 筛选 草业学报 杨祁云 王 成 冼海辉 等 海洋放线菌株 抗菌活性 及其发酵条件优化 中国海洋药物 阮宏椿 石妞妞 杜宜新 等 水稻稻瘟病拮抗稀有放线菌的筛 选及防治效果 中国生物防治学报 王飞飞 庹 利 刘佳萌 等 放线菌 的活性代谢产 物分离及菌株鉴定 中国抗生素杂志 程 亮 罗明明 吴继纲 等 海洋放线菌 中抗真菌活 性代谢产物的分离纯化与结构鉴定 中国抗生素杂志 李正鹏 苏皖平 杨 威 等 小麦全蚀病拮抗细菌 的鉴定及其生防潜力评估 江苏农业科学 小麦全蚀病拮抗细菌 的鉴定及其生防潜力评估 李正鹏 苏皖平 杨 威 宋虎卫 顾大路 刘廷武 罗玉明 江苏省环洪泽湖生态农业生物技术重点实验室 淮阴师范学院生命科学学院 江苏淮安 江苏徐淮地区淮阴农业科学研究所 江苏淮安 摘要 为获得针对小麦全蚀病的优质生防资源 从 序列分析 抑菌效果及显微观察 活性物质稳定性等 方面鉴定和评估内生细菌 及其生防潜力 结果显示 内生细菌 为铜绿假单胞菌 对靶标菌禾顶囊壳小麦变种 拮抗效果明显 引致靶标菌菌丝畸形 顶 端膨大 原生质外渗 细胞膜透性增强的现象 同时 菌株 活性物质对温度 值 紫外光照 超声波以及蛋白 酶等外界因素有良好的耐受性 由此可见 内生细菌 是一株对小麦全蚀病具备良好开发潜力的生防菌株 关键词 小麦全蚀病 假单胞菌 内生细菌 生物防治 稳定性 中图分类号 文献标志码 文章编号 收稿日期 基金项目 国家自然科学基金青年科学基金 编号 江苏 省高等学校自然科学研究面上项目 编号 作者简介 李正鹏 男 河南信阳人 博士 讲师 主要从事植 物病害综合治理研究 通信作者 罗玉明 教授 主要从事植物病害生物防治研究 由禾顶囊壳小麦变种 引起的小麦全蚀病 是世界上最重要的小 麦根部病害 因其突出的土壤传播特性 一直是小 麦亟待解决的防治难题 该病在我国安徽省 山 东省和河南省等栽培地区广泛发生 目前主要采取 化学药剂拌种的方法进行防治 而化学防治易引起 环境污染及产生抗药性 随着人们环保 绿色意 识的增强 利用微生物防控全蚀病已成为一条行之 有效的新途径 假单胞菌是广泛存在于植物根际 的一类微生物 常常具备显著防治植物病害 促进 植物生长的作用 其生防机制包括产生拮抗物 质 和铁载体或水解酶 营养竞争 生物膜的快 速形成 以及诱导植物抗性 等 因此 本研究在 前期构建的微生物资源库基础上 以禾顶囊壳小麦 变种为靶标菌 鉴定全蚀病生防菌株 并对其 拮抗效果和代谢产物稳定性进行评估 为进一步开 发利用奠定理论依据和技术支持 材料与方法 试验材料 供试病原真菌为禾顶囊壳小麦变种 由黑龙江 八一农垦大学柯希望副教授惠赠 供试生防细菌 年 月筛选自江苏 省环洪泽湖生态农业生物技术重点实验室有益微 生物资源库 编号 保存于 冰箱 试验方法 菌株活化 靶标菌 将斜面上保存的禾顶囊 壳小麦变种扩繁于 培养基上 待菌落直径长至 培养皿的一半时 待用 菌株 发酵液制备 按照前期研究结果 将 直径 的菌饼接种到种子发酵培养液 江苏农业科学 年第 卷第 期