亚油酸乙醇胺诱导番茄对灰葡萄孢抗性的作用及机制.pdf

中国农业科学 2022 55 9 1781 1789 Scientia Agricultura Sinica doi 10 3864 j issn 0578 1752 2022 09 007 收稿日期 2021 11 06 接受日期 2021 12 10 基金项目 国家自然科学基金 32172650 浙江省重点研发计划 2021C02040 联系方式 邵淑君 E mail ssjun 通信作者师恺 E mail kaishi 开放科学 资源服务 标识码 OSID 亚油酸乙醇胺诱导番茄对灰葡萄孢抗性的作用及 机制 邵淑君 胡璋健 师恺 浙江大学农业与生物技术学院 杭州 310058 摘要 背景 灰葡萄孢 Botrytis cinerea 引起的灰霉病是危害番茄 Solanum lycopersicum 的重要病害之一 防治 不及时可造成 30 40 减产 目前生产上多以化学防治为主 但存在农产品安全及环境污染的风险 N 酰基乙醇胺 NAE 是植物体内天然存在的一类脂质生物活性化合物 其在哺乳动物中具有多种免疫功能 但其在植物免疫中的作用和机制尚不 清楚 目的 探讨 N 酰基乙醇胺在诱导番茄对灰葡萄孢防御中的作用 为研发番茄灰霉病绿色防控技术提供依据 方法 将灰葡萄孢分别接种在含有硬脂酰乙醇胺 NAE 18 0 亚油酸乙醇胺 NAE 18 2 廿二碳五烯酸乙醇胺 NAE 22 5 的培 养基上 观察灰葡萄孢的生长情况 在此基础上 以番茄 Moneymaker 植株为材料 硬脂酰乙醇胺 亚油酸乙醇胺 廿二 碳五烯酸乙醇胺外源处理番茄叶片后接种灰葡萄孢 统计病情指数 测定荧光参数 采用 qRT PCR 技术明确亚油酸乙酰胺处 理后番茄叶片灰葡萄孢 Actin 的相对表达量 进一步测定番茄叶片中主要抗病基因 PI I PR 1 NPR1 Nr ACO1 PYR1a 等的相对表达量及茉莉酸 jasmonic acid JA 水杨酸 salicylic acid SA 乙烯 ethylene ETH 脱落酸 abscisic acid ABA 生长素 indoleacetic acid IAA 含量 并以乙烯信号转导突变体植株 never ripe nr 及对照植株 Pearson PB 为材料 在外源亚油酸乙酰胺处理后接种灰葡萄孢 测定番茄叶片叶绿素荧光参数和灰葡萄孢 Actin 的相对表达量 结果 体外培养试验结果表明灰葡萄孢生长并不受外源 N 酰基乙醇胺的影响 外源施用 N 酰基乙醇胺能显著提高番茄植 株对灰霉病的抗性 缓解由灰葡萄孢侵染导致的番茄叶片光系统 II 实际光化学效率 PSII 的下降 3 种 N 酰基乙醇胺中 亚油酸乙醇胺施用后番茄叶片灰霉病病情指数下降最为明显 灰葡萄孢 Actin 的相对表达量下调 60 其诱导灰霉病抗性效 果最佳 番茄植株接种灰葡萄孢后抗性基因 PI I PR 1 NPR1 Nr ACO1 的表达水平均有不同程度上调 外源亚油酸乙醇 胺处理使得番茄响应灰葡萄孢接种后 PI I Nr ACO1 的表达进一步增强 其中乙烯合成基因 ACO1 的表达水平最高 番茄植 株接种灰葡萄孢后叶片水杨酸 茉莉酸 生长素和乙烯含量增加 但外源亚油酸乙醇胺处理并接种灰葡萄孢后只有乙烯含量 显著增加 进一步研究发现 番茄乙烯突变体 nr 植株中 外源亚油酸乙醇胺对灰葡萄孢的抗性诱导作用显著受到抑制 结 论 外源施用亚油酸乙醇胺能够提高番茄内源光合效率和抗病基因的表达及内源激素乙烯的含量 增强番茄植株对灰霉病的 抗性 推测其诱导抗性作用可能与乙烯信号路径相关 关键词 番茄 N 酰基乙醇胺 亚油酸乙醇胺 灰霉病 灰葡萄孢 乙烯 The Role and Mechanism of Linoleyl Ethanolamide in Plant Resistance Against Botrytis cinerea in Tomato SHAO ShuJun HU ZhangJian SHI Kai College of Agriculture and Biotechnology Zhejiang University Hangzhou 310058 1782 中 国 农 业 科 学 55卷 Abstract Background Gray mold caused by Botrytis cinerea is one of the important diseases of tomato and causes significant yield losses up to 30 40 Nowadays chemical pesticide is usually used in tomato production which is effective but increases the risk of food safety and results in environmental pollution N acylethanolamines NAEs are a kind of naturally lipid bioactive compounds in plants which have been identified to have a variety of immune functions in mammals however its function and the underlying mechanism in plant immunity are still unclear Objective The objective of this study is to investigate the effects of NAEs on tomato plant defense against B cinerea infection and to provide a basis for the development of green control technology of tomato gray mold Method The B cinerea was cultured in medium containing NAE 18 0 NAE 18 2 NAE 22 5 respectively to evaluate their effects on B cinerea growth Tomato Moneymaker plants were infected by B cinerea with or without exogenous NAE 18 0 NAE 18 2 NAE 22 5 and disease index and fluorescence parameters of tomato leaves were measured qRT PCR was used to analyze the relative gene expression of B cinerea Actin in tomato leaves that infected by B cinerea with or without NAE 18 2 treatment Transcript abundance of defense related genes e g PI I PR 1 NPR1 Nr ACO1 PYR1a and contents of plant hormones e g JA SA ETH ABA IAA were measured Fluorescence parameters of tomato leaves and the relative gene expression of B cinerea Actin were analyzed in ethylene insensitive mutant infected by B cinerea with NAE 18 2 Result The growth of B cinerea was not affected by exogenous NAEs treatment during in vitro culture Exogenous application of NAEs could significantly improve the resistance of tomato plants to B cinerea and alleviate the decrease of photosystem II photochemical efficiency PSII caused by B cinerea infection NAE 18 2 had the best effect on tomato plant defense against B cinerea among the NAEs which obviously reduced the disease index and the Actin transcript level of B cinerea by 60 The expression levels of PI I PR 1 NPR1 Nr and ACO1 could be induced by B cinerea infection but not by NAE 18 2 treament The expression levels of PI I Nr and ACO1 were up regulated when plants were pre treated by NAE 18 2 before B cinerea infection and the expression level of ACO1 was the highest Compared to the control the contents of SA JA IAA and ETH in the leaves were increased significantly after B cinerea infection while only the contents of ETH were further increased when pre treated by NAE 18 2 Moreover exogenous NAE 18 2 pre treatment could not improve the defense against B cinerea in the ETH insensitive mutant nr Conclusion Exogenous NAE18 2 treatment can increase leaf photosynthesis transcript abundance of defense related genes and the content of plant hormone ETH It induce the resistance of tomato plants to gray mold which may depend on the ETH signaling pathway Key words tomato N acylethanolamines NAE linoleyl ethanolamide NAE 18 2 gray mold Botrytis cinerea ethylene ETH 0 引言 研究意义 番茄 Solanum lycopersicum 是世 界性栽培蔬菜 作为模式作物 被广泛用于生长发育 果实品质 逆境响应等研究 1 番茄产量和品质很大 程度上受栽培期间病虫害的影响 2 其中由灰葡萄孢 Botrytis cinerea 引起的灰霉病是番茄生产中的重要 病害 在我国各番茄种植地均有发生 感病后的番茄 产量会降低 30 40 N 酰基乙醇胺 NAE 作为 一种天然的活性物质 深入研究其在诱导番茄对灰霉 病抗性中的作用及内在机制 对于植物源生物农药的 开发具有重要意义 前人研究进展 20 世纪 50 年 代 人们最早在大豆卵磷脂和花生粕的成分中发现了 N 酰基乙醇胺 3 后续在其他植物中也发现 N 酰基乙 醇胺的存在 4 N 酰基乙醇胺是一类功能多样的脂类 信号物质 由一个酰胺键连接到乙醇胺的脂肪酸组成 根据其酰基链的碳数 C12 C18 和不饱和双键数目 0 3 进行分类 5 6 N 酰基乙醇胺普遍存在于植物 中 其种类及含量因植株器官 植物种类和生理条件 而异 长链 N 酰基乙醇胺 C16 C18 是植物中主 要的 N 酰基乙醇胺类型 主要由亚油酰乙醇胺 NAE 18 2 NAE 18 1 和 NAE 16 0 组成 其中亚油酰 乙醇胺含量最多 在植株的生长发育中发挥着重要 作用 5 7 8 N 酰基乙醇胺不仅参与种子萌发 9 11 幼 苗 生长 12 花器官衰老 13 也可能参与植物细胞防御信 号转导系统 8 1998 年 研究人员发现用真菌诱导子 木聚糖处理 会引起烟草悬浮细胞培养液中 N 酰基乙 醇胺含量积累 14 之后 N 酰基乙醇胺研究中的一个重 大突破是成功在拟南芥植株中克隆到一种 N 酰基乙 醇胺的水解酶 脂肪酸酰胺水解酶 FAAH 过 表达 FAAH 拟南芥植株中的病害防御基因 激素合成 及信号转导基因的表达量均低于野生型植株 降低了 对细菌性病原体的抗性 15 N 酰基高丝氨酸内酯 AHL 是革兰氏阴性菌群信号感应家族中的一员 是 N 酰基乙醇胺类似物 研究发现 AHL 能够增强植 株对生物与非生物逆境的抗性 16 其中 N 癸酰基高丝 氨酸内酯 DHL 作为 AHL 的一员 能够诱导番茄 植株的免疫系统来保护植物免受灰葡萄孢的侵染 17 9 期 邵淑君等 亚油酸乙醇胺诱导番茄对灰葡萄孢抗性的作用及机制 1783 本研究切入点 越来越多的研究证明环境友好型物 质 N 酰基乙醇胺在植株生长发育及抗病性中发挥着 重要作用 但外源施用 N 酰基乙醇胺是否能够有效提 高番茄植株对灰霉病的抗性及机制尚不清楚 拟解 决的关键问题 通过对灰葡萄孢接种植株表型及光合 特性的测定 探究 N 酰基乙醇胺对番茄灰霉病抗性的 影响 进一步利用 qRT PCR 以及 HPLC 技术分析外 源施用亚油酰乙醇胺对番茄植株内源抗病基因表达 激素含量的影响 并结合激素突变体植株外源施用亚 油酰乙醇胺对其灰霉病抗性的影响 探讨亚油酰乙醇 胺提高灰霉病抗性的内在机制 为番茄作物病害绿色 防控提供参考 1 材料与方法 试验于 2018 2020 年在浙江大学蔬菜研究所植 物生长室及实验室完成 1 1 试验材料及 N 酰基乙醇胺处理 1 1 1 试验材料 供试番茄材料为野生型植株 Moneymaker 乙烯信号转导突变体植株 never ripe nr 及野生型植株 Pearson PB 利用这 3 种番茄材料 分别开展两组试验 第 1 组利用不同 N 酰基乙醇胺处 理野生型植株 Moneymaker 后接种灰葡萄孢 第 2 组 用亚油酰乙醇胺处理 nr 和 PB 植株后接种灰葡萄孢 以上 3 种番茄材料均在种子温汤浸种后 播种在含有 基质 草炭 蛭石和珍珠岩比例为 6 3 1 的栽培 钵中 并置于浙江大学蔬菜研究所植物生长室中生长 其生长条件为昼夜温度 24 21 相对湿度 70 80 光周期 12 h 12 h 平均光强 600 mol m 2 s 1 1 1 2 N 酰基乙醇胺处理 硬脂酰乙醇胺 NAE 18 0 亚油酰乙醇胺 NAE 18 2 廿二碳五烯酸 乙醇胺 NAE 22 5 均购自 SIGMA 公司 原药在配 置过程中直接用 ddH 2 O 稀释至 80 mol L 1 待番茄长 至五叶一心时 选取大小 长势一致的植株进行 N 酰基乙醇胺全株喷施处理 处理组分别用上述 3 种 N 酰基乙醇胺 80 mol L 1 喷施两次 间隔 24 h 对 照组用 ddH 2 O 处理 不同 N 酰基乙醇胺 ddH 2 O 处 理 48 h 后接种浓度为 2 10 5 孢子 mL 灰葡萄孢 接种 采用喷施法 1 2 试验方法 1 2 1 灰葡萄孢孢子培养及接种 灰葡萄孢培养用 V8培养基 36 V8果汁 Campbell Soup Co Camden NJ USA 0 2 g L 1 CaCO 3 15 g L 1 琼脂 PDA 培养基 4 g L 1 马铃薯淀粉 20 g L 1 葡萄糖 15 g L 1 琼脂 和对照培养基 ddH 2 O 15 g L 1 琼脂 在 25 避光条件下培养 15 d 左右 待培养皿内长满菌丝后 将菌丝块放入重悬液 2 胰蛋白胨 4 麦芽糖 分 离过滤得到孢子 并稀释浓度至 2 10 5 孢子 mL 18 将孢子悬浮液均匀喷施在整株叶片上 以喷施重悬液 作为空白对照 接种后的番茄植株置于相对湿度 100 光周期 12 h 12 h 光强 600 mol m 2 s 1 温度 25 的环境下 3 4 d 后观察发病情况 1 2 2 番茄植株病情调查方法 番茄叶片接种灰葡 萄孢 3 d 后 观察不同处理下番茄植株灰霉病的病情 病害分级标准参照蔡银杰等 19 的方法 根据病斑面积 占叶面积百分比分为 5 级 0 级 0 1 级 0 1 10 2 级 10 1 30 3 级 30 1 70 4 级 70 病情指数计算公式 病情指数 各级叶数 该级 指数 调查总叶数 最高级别数 100 1 2 3 叶绿素荧光成像分析 叶绿素荧光使用 Imaging PAM调制荧光成像系统 IMAG MAXI Heinz Walz Germany 进行测定 植株暗适应 20 min 后 光化光强度和饱和光强度分别设为 280 和 4 000 mol m 2 s 1 光系统 实际光化学效率计算公式为 PSII Fm F Fm 20 1 2 4 植物叶片总 RNA 提取和 qRT PCR 检测 使用 RNA 提取试剂盒 Tiangen China 提取接种灰葡萄 孢后 24 h 的叶片总 RNA 使用 Fermentas RevertAid TM first Strand cDNA Synthesis Kit 合成 cDNA 第一链 使 用 iCycler iQ Multicolor 实时定量 PCR 检测系统仪器 LightCycler 480 II SwissConfederation 完成 qRT PCR 参照说明书进行操作 PCR 反应体系 10 L iQ TM SYBR Green Supermix 2 L cDNA 0 4 L 前 后引物 10 mol L 1 7 2 L ddH 2 O PCR 反应程序 95 预变性 5 min 95 变性 15 s 58 退火 45 s 40 个循环 使用 Primer 5 0 根据 SGN 上的番茄基因序列设计引物 表 1 数据采用 2 CT 法进行分析 21 1 2 5 植物内源激素含量测定 茉莉酸 jasmonic acid JA 水杨酸 salicylic acid SA 脱落酸 abscisic acid ABA 和生长素 indoleacetic acid IAA 定量 测定参照 WU 等 22 的方法 采用液相色谱质谱串联系 统进行分析 Agilent 6460 Agilent Technologies USA 在叶片提取过程中 样品加入 D5 JA D4 SA D6 ABA 和 D6 IAA OlChemlm Czechia 作为内参 乙烯 ethylene ETH 含量测定方法 每个处理 取 4棵长势一致植株的叶片密封在 1 L橡胶平顶烧瓶中 1784 中 国 农 业 科 学 55卷 表 1 qRT PCR 特异性引物 Table 1 Specific primers designed for qRT PCR 基因 Gene 前引物 Forward primer 5 3 后引物 Reverse primer 5 3 Actin TGGTCGGAATGGGACAGAAG CTCAGTCAGGAGAACAGGGT B c Actin ACTCATATGTTGGAGATGAAGCGCA AATGTTACCATACAAATCCTTACGGA PI I GAAGTAATTAAGCAGCCACAATATG GCCCCCCTTATTTTTTCC PR 1 ATCTCATTGTTACTCACTTGTC AACGAGCCCGACCA NPR1 GGGAAAGATAGCAGCACG GTCCACACAAACACACACATC PYR1a GAGAACACCGGTTGAGGAAT TGTGACTCGCATCACGACTA Nr TTTGCGTGTCCAGGTTAGAG GGAGGCATAGGTAGCAGAGG ETR2 CTAGTGCATCTAGGGTGCGA TCCATCCATTCCAACTCTCA ACO1 GCGCCACTCTATTGTGGTTA TGCATCACTTCCTGGATTGT 室温放置 1 h后用注射器从每个烧瓶中抽取出 1 mL顶部 气体 使用配备 1 5 m 4 mm 的氧化铝玻璃柱的气相 色谱仪 Philips UNICAM pro GC 测定 进样器 检测器和过柱温度分别设定为 130 130 和 200 1 3 数据统计与分析 试验结果均为 3 次重复的平均值 利用 Microsoft Excel 2016 整理数据 运用 SAS 9 1 Tukey 法进行差异 显著性分析 运用 Origin 2018 进行图形绘制 2 结果 2 1 N 酰基乙醇胺对体外培养灰葡萄孢菌丝生长的 影响 将相同大小的灰葡萄孢菌丝块分别接种在含有 80 mol L 1 硬脂酰乙醇胺 NAE 18 0 亚油酰乙醇 胺 NAE 18 2 廿二碳五烯酸乙醇胺 NAE 22 5 的 V8 培养基 PDA 培养基以及对照培养基上 于 25 避光培养 15 d 结果表明 在避光条件下培养 9 d 添 加 3 种 N 酰基乙醇胺并未对 V8 培养基和 PDA 培养基 上的灰葡萄孢生长有明显的影响 在 V8 培养基上培 养的菌落紧致均一 而在 PDA 培养基上培养的菌落整 体表现疏松 分块不均一 图 1 因此 N 酰基乙 醇胺本身并不影响灰葡萄孢的生长 且 V8 培养基最 适宜灰葡萄孢生长 2 2 外源施用 N 酰基乙醇胺对番茄灰霉病抗性的影响 为了探究 N 酰基乙醇胺在诱导番茄对灰霉病抗 性中的作用 进行了 N 酰基乙醇胺预处理番茄植株叶 V8培养基 V8 medium PDA培养基 PDA medium 对照培养基 CK medium ddH 2 O NAE 18 0 NAE 18 2 NAE 22 5 图 1 外源 N 酰基乙醇胺处理对体外培养中灰葡萄孢菌丝生长的影响 Fig 1 Effects of N acylethanolamines treatment on in vitro B cinerea hyphal growth 9 期 邵淑君等 亚油酸乙醇胺诱导番茄对灰葡萄孢抗性的作用及机制 1785 片后接种病原菌试验 一般情况下 植株遭到病原 菌侵染会对其光合系统造成不可逆的损害 因此通 过测定叶片 PSII 来评估病害的严重程度 23 由图 2 可以看出 接种灰葡萄孢的叶片 PSII 值降低 而外 源施用 N 酰基乙醇胺能够明显缓解因病原菌侵染导 致的 PSII 下降 这与灰葡萄孢 Actin 的相对表达量 一致 同时外源施用 N 酰基乙醇胺后 植株病情指 数降低至 1 2 3 因此 在硬脂酰乙醇胺 NAE 18 0 亚油酰乙醇胺 NAE 18 2 廿二碳五烯 酸乙醇胺 NAE 22 5 处理下 番茄植株对灰霉病 的抗性增强 尤以亚油酰乙醇胺处理对番茄灰霉病 的抗性最强 灰葡萄孢 B cinerea ddH 2 O NAE 18 0 NAE 18 2 NAE 22 5 ddH 2 O NAE 18 0 NAE 18 2 NAE 22 5 Mock 0 1 0 20 0 3 0 4 0 5 0 6 0 7 0 8 0 9 1 0 B C 0 0 5 1 0 1 5 ddH 2 O NAE 18 2 0 0 2 0 4 0 6 灰葡萄孢 B cinereaMock ddH 2 O NAE 22 5 A ddH2O NAE 18 0 NAE 18 2 NAE 22 5 d a c a b a c a b a b a 0 2 4 6 D NAE 18 0 b NAE 18 2 c A 番茄叶片光系统 II 实际光化学效率 Photosystem II photochemical efficiency PSII B 番茄叶片灰葡萄孢 Actin 表达量 B cinerea Actin relative expression of tomato leaves C 病情指数 Disease index D PSII 成像图 Imaging of PSII 图 2 外源施用 N 酰基乙醇胺对番茄灰霉病抗性的影响 Fig 2 Effects of exogenous N acylethanolamines on defense to tomato gray mold 2 3 外源施用亚油酰乙醇胺对番茄叶片中抗性相关 基因表达及激素含量的影响 为了探究亚油酰乙醇胺诱导的抗病性是否与内 源激素信号路径有关 检测了接种灰葡萄孢 24 h 后 番茄植株中主要抗病信号路径茉莉酸信号相关基因 PI I 水杨酸信号相关基因 PR 1 和 NPR1 脱落酸信 号路径相关基因 PYR1a 乙烯信号路径相关基因 Nr 和 ACO1 的表达量 结果表明 植株接种灰葡萄孢 24 h 后 PI I PR 1 NPR1 Nr ACO1 相对表达量表 现不同程度上调 但在外源亚油酰乙醇胺处理后接种 灰葡萄孢的番茄植株中 PR 1 NPR1 的表达量与对照 组相比无显著差异 而 PI I Nr 和 ACO1 的表达量则 有所增强 尤以乙烯合成基因 ACO1 的表达量增幅最 大 图 3 A 接种灰葡萄孢 36 h后番茄植株叶片中激素含量测 定结果表明 茉莉酸 水杨酸和生长素的含量均显著 上升 但在亚油酰乙醇胺处理下茉莉酸 水杨酸 生 长素的含量反而受到不同程度的抑制 脱落酸含量无 显著变化 乙烯含量显著增加 图 3 B 3 C 2 4 亚油酸乙醇胺对乙烯信号转导突变体番茄灰霉 病抗性的影响 鉴于亚油酸乙醇胺能提高乙烯途径基因 ACO1 的 转录表达和乙烯含量 进一步利用亚油酸乙醇胺预处 理乙烯信号转导突变株 nr 及野生型植株 PB 后接种灰 葡萄孢 接种 24 h 后对其表型进行分析 结果表明 野生型植株 PB 叶片的发病情况得到了有效缓解 PSII 值显著提高 灰葡萄孢 Actin 的相对表达量降低 了 60 而突变体 nr 植株叶片的发病情况与对照无明 1786 中 国 农 业 科 学 55卷 A 0 8 16 24 400 800 1200 相对表达量 R e la ti ve t r an s c ri pt ab un d a nc e a b c d bbba a b c aaaa a a b a b c c a a b b b d P I I PR 1 NP R1 PY R 1 a Nr ET R 2 ACO 1 ddH 2 O Mock ddH 2 O B cinerea NAE 18 2 Mock NAE 18 2 B cinerea d b c a 0 5 10 15 ddH 2 O NAE 18 2 ddH 2 O NAE 18 2 Mock 灰葡萄孢 B cinerea 乙烯含量 ETH co nten t un i t nL g 1 FW h 1 B b c a b 0 5 10 15 20 生长素含量 I A A content unit ng g 1 FW c d a b 20 40 60 茉莉酸含量 J A cont ent u nit ng g 1 FW a a a a 200 400 600 800 bc c a b 20 40 60 水杨酸含量 SA con t ent uni t n g g 1 FW 0 ddH 2 O NAE 18 2 ddH 2 O NAE 18 2 Mock 灰葡萄孢 B cinerea ddH 2 O NAE 18 2 ddH 2 O NAE 18 2 Mock 灰葡萄孢 B cinerea 0 ddH 2 O NAE 18 2 ddH 2 O NAE 18 2 Mock 灰葡萄孢 B cinerea 0 脱落酸含量 A B A cont ent u nit ng g 1 FW ddH 2 O NAE 18 2 ddH 2 O NAE 18 2 Mock 灰葡萄孢 B cinerea C 图 3 外源施用亚油酸乙醇胺对番茄叶片中抗病基因表达 A 和内源激素含量 B C 的影响 Fig 3 Effects of exogenous NAE 18 2 on the transcript abundance of defense related genes A and the endogenous hormone content B C under B cinerea infection in tomato plants 显差异 PSII 值及灰葡萄孢 Actin 的相对表达量均无 明显变化 图 4 表明亚油酸乙醇胺诱导的抗病性 依赖于乙烯信号通路 3 讨论 3 1 N 酰基乙醇胺对植株的抗性诱导作用 N 酰基乙醇胺的功能以及代谢在动物中已有大量 的研究 研究最为广泛的 N 花生四烯乙醇胺 NAE 20 4 能够与受体结合 触发一系列信号转导事件 从而调节动物的痛觉 能量平衡 恐惧 食欲 记忆 等多种生理和行为过程 24 进一步研究发现 这些脂 肪酸酰胺也是植物体的内源成分 其积累和代谢在植 株生长发育及免疫等方面发挥着重要的作用 例如 当烟草叶片受到真菌激发子刺激时 N 酰基乙醇胺的 水平上升 10 50 倍 暗示其可能在植株免疫中发挥一 定的调控作用 15 植物中 N 酰基乙醇胺能够参与种子 萌发 叶绿体发育等生长发育调控 25 26 但对病原菌 的响应及调控机制尚不清楚 本研究发现 3 种 N 酰 基乙醇胺均能提高番茄植株对灰霉病的抗性 其中亚油 酸乙醇胺的抗性诱导效果最好 亚油酸乙醇胺处理下 的番茄接种灰葡萄孢后 其灰葡萄孢的生长量与对照 组 ddH 2 O 处理相比下降了 60 图 2 目前生产上 防治灰霉病主要依靠化学药剂 已陆续检测到番茄灰 霉病对腐霉利等药剂产生不同程度的抗药性 防治效 9 期 邵淑君等 亚油酸乙醇胺诱导番茄对灰葡萄孢抗性的作用及机制 1787 C PB PB NAE 18 2 nr nr NAE 18 2 PB PB NAE 18 2 nr nr NAE 18 2 Mock 灰葡萄孢 B cinerea 0 1 0 20 0 3 0 4 0 5 0 6 0 7 0 8 0 9 1 0 d ab c a e b e b 0 0 1 0 2 0 3 0 4 a b a c 0 0 5 1 0 1 5 2 0 2 5 PB nr PB PB NAE 18 2 nr nr NAE 18 2 Mock 灰葡萄孢 B cinerea 灰葡萄孢 B cinerea NAE 18 2 B cinerea 光系统 II 实际光化学效率 PS I I 相对表达量 Relati ve trans c ri pt ab und ance AB A 番茄叶片光系统 II 实际光化学效率 Photosystem II photochemical efficiency PSII B 番茄叶片灰葡萄孢 Actin 表达量 B cinerea Actin relative expression of tomato leaves C 番茄叶片 PSII 成像图 Imaging of PSII 图 4 外源施用亚油酸乙醇胺对乙烯信号转导突变体番茄灰霉病抗性的影响 Fig 4 Effects of exogenous NAE 18 2 on nr tomato plant defense to gray mold 果显著下降 27 因此 寻找化学合成农药的新替代 品已经成为科学研究的一个重要方向 本研究发现 亚油酸乙醇胺对番茄灰霉病诱导抗性效果最佳 其 类似物 DHL 已被证实能够诱导番茄植株的系统抗 性来保护植物免受灰葡萄孢的侵染 17 这些活性物 质的发现以及未来的开发应用将有助于病害的绿色 防控 3 2 N 酰基乙醇胺诱导植株抗性与激素途径的关系 植物免疫调控离不开植物激素 灰葡萄孢的侵染 提高了植物体内乙烯 茉莉酸 水杨酸 脱落酸含量 保持激素调控网络的内在平衡是植株免疫的关键 28 本研究中 番茄植株受灰葡萄孢侵染后 其乙烯 茉 莉酸 水杨酸含量均有一定程度提高 与前人研究结 果一致 但在亚油酸乙醇胺处理下 番茄叶片中乙烯 含量显著升高 茉莉酸 水杨酸 生长素的含量反而 受到了不同程度的抑制 而脱落酸含量无显著差异 图 3 有研究报道 植株提高对死体营养型病原菌抗性 主要依赖于茉莉酸和乙烯信号路径 29 30 水杨酸和脱 落酸在植物对灰霉病的抗性中作用复杂 其可能和植 物的种类 灰葡萄孢侵染的阶段 受侵染的组织等相 关 31 大量研究已证明 乙烯合成途径关键酶 ACO 基因表达量提高是乙烯产生增加的重要指标 32 33 植株遭受病原菌侵染后 乙烯合成途径被激活 产生 大量乙烯 34 35 随着乙烯水平的上升 下游抗性相关 基因的表达也增强 36 37 本研究中番茄植株在外源施 用亚油酸乙醇胺并接种病原菌后 乙烯信号路径相关 基因 ACO1 大量表达 图 3 A 与已经报道的免疫 反应模式一致 已有研究表明拟南芥乙烯不敏感 ein2 ein3 和乙烯受体 etr1 突变体因改变了乙 烯信号而导致其对灰葡萄孢的敏感性 过表达 ERF1 则增强了拟南芥植株对灰葡萄孢的抗性 38 番茄蛋白 激酶 TPK1b 介导了乙烯信号路径参与的防御作用 39 这些结果均表明 乙烯信号通路在植株对灰霉病的防 御中发挥着重要作用 本研究发现 在番茄乙烯信号 转导突变体植株 nr 上外源施用亚油酸乙醇胺后再接 种病原菌 削弱了亚油酸乙醇胺对灰葡萄孢的抗性作 用 图 4 推测亚油酸乙醇胺诱导的抗病性依赖于 乙烯信号通路 研究表明 乙烯和茉莉酸信号通路在灰霉病抗性 中具有协同作用 乙烯和茉莉酸信号通路是相互关联 1788 中 国 农 业 科 学 55卷 的 茉莉酸甲酯 MeJA 能够诱导 ACO 的表达 导 致乙烯生成增加 28 本试验中番茄植株在外源施用亚 油酸乙醇胺后接种灰葡萄孢 叶片中乙烯含量显著增 加 茉莉酸含量反而受到了一定程度的抑制 但较未 接种灰葡萄孢的对照组相比 乙烯 茉莉酸含量均显 著升高 且茉莉酸信号通路基因 PI I 的转录表达上调 图 3 可能也是乙烯 茉莉酸协同防御的一种表现 因此 在未来的研究中 还需要对茉莉酸信号通路及 两者的调控网络展开进一步研究 4 结论 外源施用亚油酸乙醇胺能够显著提高番茄光合作 用和抗病基因的表达及内源激素乙烯的含量 有效诱 导番茄植株对灰霉病的抗性 参考文献 References 1 PANTHEE D R CHEN F Genomics of fungal disease resistance in tomato Current Genomics 2010 11 1 30 39 2 SINGH V K SINGH A K KUMAR A Disease management of tomato through PGPB Curre