防治蔬菜灰霉病枯草芽胞杆菌BAB-1水分散片剂的研制.pdf

38 2 404 413 中国生物防治学报 Chinese Journal of Biological Control 2022 年 4 月 收稿日期 2021 04 30 基金项目 河北省重点研发计划 20326515D 河北省农林科学院现代农业科技创新工程 2019 1 2 03 作者简介 共同第一作者 敖明远 硕士 E mail aomy163 张晓云 硕士 副研究员 E mail zxy zxl 通信作者 博士 研究员 E mail shezengli DOI 10 16409 ki 2095 039x 2021 08 003 防治蔬菜灰霉病枯草芽胞杆菌 BAB 1水分散片剂的研制 敖明远 1 张晓云 1 郭庆港 1 曲远航 1 鹿秀云 1 崔建州 2 李社增 1 马 平 1 1 河北省农林科学院植物保护研究所 河北省农业有害生物综合防治工程技术研究中心 农业部华北北部作物有害生物综合治理重点实验室 保定 071000 2 河北农业大学林学院 保定 071000 摘要 枯草芽胞杆菌BAB 1是一株有效防治蔬菜灰霉病和白粉病的生防细菌 为提高该菌株的应用潜力 本研究以BAB 1菌株为有效成分开展水分散片剂的研制 通过生物相容性试验 正交试验和单因素试验对 崩解剂 粘结剂及分散剂进行筛选 最终确定100亿CFU g枯草芽胞杆菌BAB 1水分散片剂的适宜配方 为酒石酸5 碳酸氢钠25 氯化钠0 5 乳糖5 PEG6000 2 NNO 4 BAB 1母药补足至100 质量检测结果表明 该水分散片剂崩解时间为272 17 s pH值为5 75 悬浮率为73 77 产品各项指标 均符合要求 温室盆栽试验结果表明 该制剂500倍液处理能够有效防治黄瓜与番茄灰霉病 防效分别达 到84 11 和75 15 与对照药剂43 氟菌 肟菌酯 露娜森 1000倍液的防治效果无显著性差异 76 25 与84 85 但显著高于2亿孢子 g木霉菌可湿性粉剂500倍液 62 71 与57 95 关 键 词 枯草芽胞杆菌 水分散片剂 灰霉病 微生物杀菌剂 中图分类号 S476 文献标识码 A 文章编号 1005 9261 2022 02 0404 10 Development of Bacillus subtilis BAB 1 Water Dispersible Tablet to Control Vegetable Gray Mold AO Mingyuan 1 ZHANG Xiaoyun 1 GUO Qinggang 1 QU Yuanhang 1 LU Xiuyun 1 CUI Jianzhou 2 LI Shezeng 1 MA Ping 1 1 IPM Center of Hebei Province Key Laboratory of Integrated Pest Management on Crops in Northern Region of North China Ministry of Agriculture and Rural Affairs Institute of Plant Protection Hebei Academy of Agricultural and Forestry Sciences Baoding 071000 China 2 College of Forestry Hebei Agricultural University Baoding 071000 China Abstract Bacillus subtilis BAB 1 exhibited strong control effect on vegetable gray mold and powdery mildew To improve the application potential with B subtilis BAB 1 as active ingredient a formulation of strain BAB 1 water dispersible tablet WT was developed The optimized disintegrant binder and dispersant were screened by biocompatibility test orthogonal test or single factor test and the final formulation of 10 billion CFU g B subtilis BAB 1 WT was determined as 5 tartaric acid 25 sodium bicarbonate 0 5 sodium chloride 5 lactose 2 PEG6000 4 NNO and up to 100 by strain BAB 1 technical material The quality of this formulation was satisfied with dispersion time of 272 17 s pH 5 75 and suspension rate of 73 77 Pot test showed the 500 fold aqueous solution treatment of BAB 1 WT could effectively control gray mold on cucumber and tomato with control efficacy of 84 11 and 75 15 respectively There was no significant difference in the control effect between the BAB 1 WT and the 1000 fold aqueous solution of 43 trifloxystrobin fluopyram Lunasen 76 25 and 84 85 but significantly higher than that of the 500 fold aqueous solution of 2 10 8 conidia g Trichoderma WP 62 71 and 57 95 第 2 期 敖明远等 防治蔬菜灰霉病枯草芽胞杆菌 BAB 1 水分散片剂的研制 405 Key words Bacillus subtilis water dispersible tablet grey mold microbial fungicide 蔬菜 番茄 黄瓜等 灰霉病是由灰葡萄孢菌 Botrytis cinerea 引起的一类真菌性病害 在我国绝大多 数保护地栽培蔬菜区均有发生 常造成巨大经济损失 1 蔬菜灰霉病的防治主要依赖化学杀菌剂 但长期 大量 频繁使用化学农药导致病原菌产生抗药性 化学农药残留及环境污染等一系列问题 2 5 因此 为达 到减量或替代化学农药使用的目的 研发和利用环保高效的新型微生物杀菌剂 成为国内外植物保护工作 者的研究热点 剂型是农药有效成分的最终使用形式或状态 生防微生物可通过加工成合适的剂型 达到提高其生物 活性 扩大使用方式和用途等目的 微生物杀菌剂的剂型主要有固态制剂 如粉剂 颗粒剂 水分散粒剂 和可湿性粉剂等 和液态制剂 如水剂 悬浮剂等 6 目前 美国已有 35 种防治灰霉病的微生物杀菌剂 通过农药登记 有效成分涉及枯草芽胞杆菌 Bacillus subtilis 解淀粉芽胞杆菌 B amyloliquefaciens 短小芽 胞杆菌 B pumilus 地衣芽胞杆菌 B licheniformis 钩状木霉菌 Trichoderma hamatum 荧光假单胞菌 Pseudomonas fluorescens 奥德曼细基格孢菌 Ulocladium oudemansii 链孢粘帚霉 Gliocladium catenulatum 灰绿链霉菌 Streptomyces griseoviridis 利迪链霉菌 S lydicus 酵母 Yesat 黑酵母菌 Aureobasidium pullulans 寡雄腐霉 Pythium oligandrum 及麝香霉 Muscodor albus 相关剂型包括乳油 10 个产品 28 6 悬浮剂 5 个产品 14 3 颗粒剂 2 个产品 5 7 可湿性粉剂 5 个产品 14 3 可溶液剂 6 个产品 17 1 水剂 2 个产品 5 7 及粉剂 1 个产品 2 9 7 种 7 乳油与可溶液剂为美 国登记的防治灰霉病的微生物杀菌剂的主要剂型 欧盟仅有 3 种防治灰霉病的微生物杀菌剂通过农药登记 有效成分分别为解淀粉芽胞杆菌 FZB24 粉红粘帚霉 Coniothyrium minitans J1446 及酿酒酵母 Saccharomyces cerevisiae LAS02 剂型有可湿性粉剂 2 个产品 67 与水分散粒剂 1 个产品 33 2 种 8 我国已有 28 个防治灰霉病的微生物杀菌剂产品通过国家农药登记 有效成分涉及哈茨木霉菌 T harzianum 木霉菌 T sp 枯草芽胞杆菌 海洋芽胞杆菌 B marinus 甲基营养型芽胞杆菌 B methylotrophicus 及荧光假单胞菌 P fluorescens 防治对象有草莓灰霉病 番茄灰霉病 黄瓜灰霉病 葡萄灰霉病及人参灰 霉病等 6 种病害 但在剂型方面表现单一 仅有可湿性粉剂 25 个产品 89 和水分散粒剂 3 个产品 11 2 种剂型 9 相比美国而言 我国的微生物杀菌剂剂型种类单一 此外 颗粒剂 水分散粒剂 悬浮 剂和可溶液剂一般被认为是环保型制剂 而其他制剂在应用过程中均产生二次污染 远远不能满足绿色农 业生产的需求 因此 开发新型环保型制剂十分必要 水分散片剂是列于我国国家农药制剂标准中的剂型 指在水中崩解 有效成分分散成悬浮液的片状制 剂 10 在加工过程中 该剂型将母药 润湿剂 分散剂 崩解剂 粘结剂及填料等混合后经高压压制而成 重量固定的片剂 具备入水后崩解快 有效成分能迅速均匀分布在溶液体系中的特点 11 该类制剂运输 携带及使用方便 同时在生产环节和使用过程中无粉尘飞扬 最大程度的减少了环境污染 12 13 但由于水 分散片剂的加工工艺还存在诸多问题 导致国内水分散片制剂的品种较少 目前仅有 2 个水分散片剂产品 通过国家农药登记 其有效成分分别为苯噻酰 五氟磺 硝磺草 除草剂 PD20211114 与 1 甲基环丙烯 植 物生长调节剂 PD20170964 9 尚无微生物农药水分散片剂的登记 同时有关微生物农药水分散片剂配 方筛选的报道亦较少 王勇等 14 吕跃东等 15 16 曾报道绿色木霉 烯酰吗啉水分散片剂 300 600 倍液能够 有效防治番茄灰霉病 黄瓜枯萎病及棉花黄萎病 防效分别达到 83 95 81 89 与 88 97 本研究以有效防治蔬菜灰霉病的生防枯草芽胞杆菌 BAB 1 17 为研究对象 通过对适用助剂 崩解剂 粘结 剂 分散剂 种类和用量进行筛选 确定水分散片剂的适宜配方 并采用盆栽试验评价其防治效果 为该 菌株进一步产业化提供科学依据 1 材料与方法 1 1 供试材料 供试药剂 枯草芽胞杆菌 BAB 1 CGMCC No 2099 母药 由河北省农林科学院植物保护研究所生 产 含量为 2 10 10 CFU g 2 亿孢子 g 木霉菌可湿性粉剂 PD20170879 山东康惠植物保护有限公司生 406 中 国 生 物 防 治 学 报 第 38 卷 产 露娜森 PD20152429 43 氟菌 肟菌酯 拜耳股份公司生产 供试助剂 3 种崩解剂 5 种分散剂及 5 种粘结剂 详细信息见表 1 表 1 供试助剂信息表 Table 1 The information of tested additives 助剂 Additives 用途 Usage 生产厂家 Manufacturer 助剂 Additives 用途 Usage 生产厂家 Manufacturer 酒石酸 崩解剂 上海源叶生物科技有限公司 GY D10 分散剂 北京广源益农化学有限责任公司 碳酸氢钠 崩解剂 天津市福晨化学试剂厂 聚乙烯吡咯烷酮 K30 PVP K30 粘结剂 北京索莱宝科技有限公司 氯化钠 崩解剂 天津市福晨化学试剂厂 乳糖 粘结剂 上海源叶生物科技有限公司 亚甲基双萘磺酸钠 NNO 分散剂 山东优索化工科技有限公司 淀粉 粘结剂 上海源叶生物科技有限公司 聚萘甲醛磺酸钠盐 MF 分散剂 山东优索化工科技有限公司 聚乙二醇 6000 PEG6000 粘结剂 上海源叶生物科技有限公司 木质素磺酸钠 分散剂 上海源叶生物科技有限公司 糊精 粘结剂 上海源叶生物科技有限公司 SP 2836 分散剂 江苏擎宇化工科技有限公司 供试作物品种 黄瓜品种为津优 1 号 天津科润农业科技股份有限公司生产 番茄品种为奥赛特 968 北京硕源种子有限公司生产 1 2 枯草芽胞杆菌 BAB 1 水分散片剂配方助剂种类筛选 以枯草芽胞杆菌 BAB 1 菌株的存活情况为评价指标 依据各供试助剂与菌株 BAB 1 间的生物相容性 而确定助剂种类 针对各助剂在水中的溶解性设计以下两种测定方法 1 2 1 可溶于培养基的助剂与菌株BAB 1间生物相容性 崩解剂与分散剂均可溶于水 故采用平板菌落计 数法评价这两类助剂与菌株 BAB 1 的相容性 参考刘盼西等 18 方法 并略作修改 称取 BAB 1 菌株母药 10 0 g 加入到含有 90 mL 无菌水的三角瓶中 180 r min 振荡培养 30 min 得到浓度为 0 1 g mL 的溶液 采用系列稀释法制成 1 10 7 和 1 10 8 g mL 稀释液 各取 100 L 分别均匀涂布于助剂终浓度为 1 3 5 w v 的 LB 固体培养基 胰蛋白胨 10 0 g 酵母浸粉 5 0 g 氯化钠 5 0 g 琼脂 12 0 g 蒸馏水 1000 mL 平板上 35 恒温培养 12 h 后记录每个平板上的菌落数 每个供试助剂每个浓度处理重复 3 次 以不添 加助剂的 LB 平板作为对照 1 2 2 不溶于培养基的助剂与BAB 1菌株间相容性 由于粘结剂在水中溶解性能差 故本部分主要针对粘 结剂开展生物相容性研究 将供试粘结剂按 1 3 5 w v 的比例与 LB 培养基混合 经湿热灭菌 后充分混合制成 LB 固体培养基平板 将活化的菌株 BAB 1 单菌落划线接种于含有不同粘结剂的平板上 30 恒温培养 24 h 后观察其生长情况 每种供试粘结剂每个浓度处理重复 3 次 以不添加粘结剂的 LB 固体培养基平板作为对照 1 3 枯草芽胞杆菌 BAB 1 水分散片剂崩解剂最佳用量的确定 固定水分散片剂配方中其他组分不变 采用 L 9 3 3 正交表进行 3 因素 3 水平正交试验 以崩解时间作 为评价指标 确定最佳崩解剂的用量及适宜组合 试验因素水平设置列于表 2 1 4 枯草芽胞杆菌 BAB 1 水分散片剂粘结剂及其用量的筛选 固定水分散片剂配方中其他组分不变 单因素更换不同比例的粘结剂压制成水分散片剂 参考范春然 19 表 2 崩解剂优化正交试验设计因素及水平 Table 2 The factors and levels of disintegrant in orthogonal test 因素 Factor 水平 Level 酒石酸 Tartaric acid A 碳酸氢钠 Sodium bicarbonate B 氯化钠 Sodium chloride C 1 5 15 0 5 2 10 20 1 3 15 25 2 第 2 期 敖明远等 防治蔬菜灰霉病枯草芽胞杆菌 BAB 1 水分散片剂的研制 407 的方法 以片剂的外观和可压性作为考察指标 片剂表面光洁度和可压性分别分为 5 级 最优的记 5 分 最差的记 1 分 以二者得分之和评价片剂优劣 得分最高者为最佳组合 1 5 枯草芽胞杆菌 BAB 1 水分散片剂分散剂用量的确定 固定水分散片剂配方中其他组分不变 单因素更换不同比例的分散剂 1 2 3 及 4 压制 成水分散片剂 以悬浮率为指标 确定分散剂的最佳用量 1 6 枯草芽胞杆菌 BAB 1 水分散片剂的加工方法 将一定比例的崩解剂 粘结剂及分散剂与菌株 BAB 1 母药混合 经混合机 VH 2 型 上海天阖机械 设备有限公司 充分混匀后 用单冲电动压片机 DTB 3 型 上海天阖机械设备有限公司生产 直接干粉 压片成水分散片 获得枯草芽胞杆菌 BAB 1 水分散片剂 1 7 枯草芽胞杆菌 BAB 1 水分散片剂质量指标测定 根据 中华人民共和国药典 中水分散片剂或微生物农药相关国家标准中的测定方法对水分散片剂的 活菌含量 pH 值 崩解时间 片重差异 悬浮率等性状进行测定 1 7 1 活菌含量测定 采用平板菌落计数法 20 测定水分散片剂的活菌含量 1 7 2 pH值测定 随机抽取水分散片 1 片 投入 50 mL 水中 充分溶解搅匀测定 pH 值 重复 6 次 21 1 7 3 崩解时限检查 随机抽取水分散片 1 片 投入装有 200 mL 水的烧杯中 水温为 15 25 当 片剂或碎片周围气体不再逸出 片剂应崩解 溶解或分散于水中 此时结束计时 重复 6 次 21 1 7 4 片重差异测定 随机抽取水分散片 20 片 称量总重量 求得平均片重后 再分别称定各片重量 每 片的重量与平均质量相比 片重差异需在 5 以内 超过重量差异限度数量不多于 2 片 且不能有 1 片超 过限度 1 倍 21 1 7 5 悬浮率测定 悬浮率测定采用国家标准农药可湿性粉剂悬浮率测定方法 GB T14825 2006 22 1 8 枯草芽胞杆菌 BAB 1 水分散片剂对蔬菜灰霉病的防效评价 采用盆栽试验评价枯草芽胞杆菌 BAB 1 水分散片剂对番茄灰霉病与黄瓜灰霉病的防治效果 试验共设 5 个处理 枯草芽胞杆菌 BAB 1 水分散片剂 500 倍水稀释液 枯草芽胞杆菌 BAB 1 水分散 片剂 1000 倍水稀释液 2 亿孢子 g 木霉菌可湿性粉剂 500 倍水稀释液 露娜森 1000 倍水稀释液以及清水 对照 选择生长 10 d 左右子叶完全展开的黄瓜幼苗及生长 60 d 左右 3 4 片真叶的番茄幼苗 将不同药液均 匀喷施于黄瓜与番茄叶面 平均 4 mL 株 待叶面药液自然风干 24 h 后 将番茄灰霉病病原菌灰葡萄孢 菌 BC 15 河北省农林科学院植物保护研究所分离并保存 菌盘 5mm 贴接于黄瓜叶片中部及番茄 每片复叶上部 3 片小叶中部 每处理 3 次重复 每重复 10 株 病原菌接种后移入 25 恒温 光照 黑暗 16 h 8 h 相对湿度 90 的人工气候室内 培养 3 d 后开始观察发病情况 当空白对照充分发病时 按 下面的分级标准调查各处理发病情况 并计算各处理的病情指数和防治效果 病情严重度分级标准 0 级 无病斑 1 级 病斑面积占叶面积 5 以下 3 级 病斑面积占叶面积 5 15 5 级 病斑面积占叶面积 16 25 7 级 病斑面积占叶面积 26 50 9 级 病斑面积占叶面 积 50 以上 病情指数 各级病叶数 相应病级值 调查叶总数 最高病级值 100 防治效果 对照病情指数 处理病情指数 对照病情指数 100 1 9 数据统计与分析 正交试验设计及数据分析皆采用 minitab16 软件进行处理 应用 SPSS 19 0 软件邓肯氏新复极差多重比 较法对试验数据进行显著性差异分析 2 结果与分析 2 1 助剂与枯草芽胞杆菌 BAB 1 的生物相容性 采用平板菌落计数法研究 3 种崩解剂及 5 种分散剂与枯草芽胞杆菌 BAB 1 的生物相容性 结果表明 崩解剂酒石酸 碳酸氢钠 氯化钠与菌株 BAB 1 生物相容性较好 在 1 3 及 5 浓度时该菌株均可良 好生长且无显著性差异 图 1A C 分散剂 NNO 与菌株 BAB 1 生物相容性最好 在 1 3 与 5 浓度 408 中 国 生 物 防 治 学 报 第 38 卷 下该菌株均可良好生长且与对照无显著性差异 GY D10 与菌株 BAB 1 生物相容性较好 在 1 与 3 浓度 下不影响该菌株生长 但 5 浓度时菌株 BAB 1 生长显著低于对照 MF 在 1 和 3 浓度时 菌株 BAB 1 生长显著低于与对照 5 浓度时则完全受到抑制 木质素磺酸钠和 SP 2836 与 BAB 1 菌株生物相容性较 差 仅在 1 浓度时菌株 BAB 1 能够生长 并显著低于对照 3 和 5 浓度时则完全受到抑制 图 2A C a aa a 0 50 100 150 200 250 a a a a 0 50 100 150 200 250 a a aa 0 50 100 150 200 250 CK 酒石酸 Tartaric acid 碳酸氢钠 Sodium bicarbonate 氯化钠 Sodium chloride 助剂 Agent 菌含量 Con c en tratio n 10 8 CFU g 菌含量 Con c en trati on 1 0 8 CFU g 菌含量 Concentrat ion 10 8 CFU g CK 酒石酸 Tartaric acid 碳酸氢钠 Sodium bicarbonate 氯化钠 Sodium chloride CK 酒石酸 Tartaric acid 碳酸氢钠 Sodium bicarbonate 氯化钠 Sodium chloride A B C A 1 B 3 C 5 图 1 不同崩解剂对枯草芽胞杆菌 BAB 1 生长的影响 Fig 1 The effect of different disintegrants on the growth of B subtilis BAB 1 采用毒性平板法评价了 5 种粘结剂与枯草芽胞杆菌 BAB 1 的生物相容性 结果表明 在试验浓度范围 内 除 PVP K30 在高浓度 5 对枯草芽胞杆菌 BAB 1 生长表现抑制作用外 其他粘结剂 PEG6000 淀 粉 糊精 乳糖均不影响 BAB 1 菌株的生长 图 3A E 2 2 崩解剂适宜用量的确定 以崩解时间为指标 对碳酸氢钠 酒石酸和氯化钠 3 种崩解剂的最适用量进行筛选 正交试验结果 表 3 表明 各因素水平组合间崩解时间差异较大 直观分析结果表明处理 9 A3B3C2 崩解时间最短 274 s 而正交试验结果分析表明 碳酸氢钠 B 的 delta 值最大 说明碳酸氢钠的用量对水分散片剂崩解 时间的影响最大 其次为酒石酸 A 氯化钠 C 的影响最小 表 3 因此最佳组合应为 A2B3C2 经进一步试验验证 A2B3C2 与 A3B3C2 两种组合崩解时间无显著性差异 对正交试验结果的方差分 第 2 期 敖明远等 防治蔬菜灰霉病枯草芽胞杆菌 BAB 1 水分散片剂的研制 409 a a b a c c 0 50 100 150 200 250 CK NNO MF GY D10 SP 2836 助剂 Agent a a b a cc 0 50 100 150 200 250 CK NNO MF GY D10 SP 2836 木质素磺酸钠 Sodium ligninsulfonate 菌含量 Concentr ation 10 8 CFU g a a c b cc 0 50 100 150 200 250 CK NNO MF GY D10 SP 2836 木质素磺酸钠 Sodium ligninsulfonate 木质素磺酸钠 Sodium ligninsulfonate 菌含量 Co ncentrati on 1 0 8 CFU g 菌含量 Co ncen trati on 1 0 8 CFU g A B C A 1 B 3 C 5 图 2 不同分散剂对枯草芽胞杆菌 BAB 1 生长的影响 Fig 2 The effect of different dispersants on the growth of B subtilis BAB 1 AB CDE CK 1 3 5 CK 1 3 5 CK 1 3 5 CK 1 3 5 CK 1 3 5 A PEG6000 B PVP K30 C 淀粉 Starch D 糊精 Dextrin E 乳糖 Lactose 图 3 不同粘结剂与枯草芽胞杆菌 BAB 1 的生物相容性评价 Fig 3 The biocompatibility evaluation between different binders and B subtilis BAB 1 410 中 国 生 物 防 治 学 报 第 38 卷 析 表 4 表明 因素 B 的 P 0 05 即碳酸氢钠对崩解时间的影响显著 P 0 05 因素 A 的 P 0 10 即酒石酸对崩解时间有一定的影响 因素 C 的 P 0 10 即氯化钠对其无显著性影响 因此 综合直观分 析与方差分析的结果 再加上成本因素考虑 选择 A1B3C1 为最佳组合 即酒石酸 5 碳酸氢钠为 25 氯化钠为 0 5 表 3 崩解剂配比优化的正交试验结果 Table 3 The results of orthogonal test to optimize disintegrant proportion 处理 Treatments 酒石酸 Tartaric acid 碳酸氢钠 Sodium bicarbonate B 氯化钠 Sodium chloride C 崩解时间 Disintegration time s 1 1 1 1 298 2 1 2 2 287 3 1 3 3 279 4 2 1 2 288 5 2 2 3 286 6 2 3 1 276 7 3 1 3 292 8 3 2 1 286 9 3 3 2 274 k 1 288 0 292 7 286 7 k 2 283 3 286 3 283 0 k 3 284 0 276 3 285 7 delta 4 7 16 3 3 7 排秩 Rank Cases 2 1 3 注 k 1 k 2 和 k 3 分别代表各因素水平下水分散片剂崩解时间的均值 Note k 1 k 2 and k 3 represent the mean disintegration time of the tested formulation at different disintegrant dosages 表 4 正交试验结果方差分析表 Table 4 Analysis of variance of orthogonal design results 因素 Factor 偏差平方和 Sum of square of deviations 自由度 Degree of freedom 均方 Mean square F P A 38 222 2 19 111 9 053 0 099 B 406 889 2 203 444 96 374 0 010 C 21 556 2 10 778 5 106 0 164 误差 Error 4 222 2 2 111 2 3 粘结剂的筛选 以水分散片剂的外观和可压性作为评价指标 对粘结剂的种类及含量进行筛选 结果表明 以 2 PEG6000 和 5 乳糖配方压片形成的水分散片剂得分最高 10 表 5 该组合形成的片剂硬度适中 表面光滑平整 综合性能优于其他粘结剂组合 2 4 分散剂的筛选 2 1 结果表明分散剂 NNO 和 GY D10 与枯草芽胞杆菌 BAB 1 生物相容性较好 结合成本考虑 选择 NNO 作为水分散片剂的分散剂 通过单因素试验评价了不同 NNO 用量对水分散片剂悬浮率的影响 结果 表明 随着 NNO 用量的增加 水分散片剂的悬浮率逐渐提高 当用量为 4 时 悬浮率最高达到 69 1 因此选择 4 为最佳用量 图 4 2 5 水分散片剂最佳配方的确定及主要性能指标 通过以上配方筛选试验 确定了枯草芽胞杆菌 BAB 1 水分散片剂适宜配方 崩解剂 酒石酸 5 碳 酸氢钠 25 氯化钠 0 5 粘结剂 乳糖 5 PEG6000 2 分散剂 NNO 4 菌株 BAB 1 母药补足至 100 最终研制成枯草芽胞杆菌 BAB 1 水分散片剂 该片剂的直径为 1 5 cm 厚度 0 4 cm 硬度适中 第 2 期 敖明远等 防治蔬菜灰霉病枯草芽胞杆菌 BAB 1 水分散片剂的研制 411 表 5 不同粘结剂及其用量对水分散片剂质量的影响 Table 5 The effect of different binders and their dosages on BAB 1 WT quality 处理 Treatment PEG6000 PVP K30 淀粉 Starch 糊精 Dextrin 乳糖 Lactose 光洁度 Smoothness 可压性 Compatibility 总分 Total score 1 0 0 0 0 0 1 1 2 2 0 5 0 0 0 2 2 4 3 0 0 5 0 0 2 2 4 4 0 0 0 5 0 2 4 6 5 0 0 0 0 5 2 5 7 6 2 5 0 0 0 5 2 7 7 2 0 5 0 0 5 2 7 8 2 0 0 5 0 5 4 9 9 2 0 0 0 5 5 5 10 注 表中供试助剂列中数据为在其供试制剂中的用量 w w Note Data in the tested adjuvant column is the dosage percentage ratio w w in the tested formulation a b c d 0 20 40 60 80 CK 2 3 4 添加比例 Addition proportion 图 4 不同 NNO 用量对水分散片剂悬浮率的影响 Fig 4 The effect of different dosages of NNO on suspension rate of BAB 1 WT 表面光滑平整 片重为 1 5681 0 0080 g 有效 成分含量为 100 亿 CFU g 崩解时间 272 17 s pH 值 5 75 悬浮率为 73 77 表 6 2 6 枯草芽胞杆菌 BAB 1 水分散片剂对番茄和黄 瓜灰霉病防治效果 通过温室盆栽试验评价了该制剂对黄瓜灰霉 病和番茄灰霉病的防治效果 结果表明 当清水对 照处理病情指数达到 33 75 黄瓜灰霉病 和 37 51 番茄灰霉病 时 枯草芽胞杆菌水分散片剂 500 表 6 枯草芽胞杆菌 BAB 1 水分散片剂的主要性状 Table 6 The main characteristics of Bacillus subtilis BAB 1 WT 指标 Index 测定结果 Tested results 有效成分含量 content of active ingredient 100 亿 CFU g pH 5 75 0 07 片重 Tablet weight 1 5681 0 0080 崩解时间 Time 272 17 3 31 s 悬浮率 Suspension rate 73 77 1 36 倍与 1000 倍水稀释液处理能显著降低黄瓜和番茄灰霉病的病情指数 表明两处理的防治效果显著 表 7 该制剂两个浓度处理对黄瓜灰霉病的防治效果分别为 84 11 和 79 48 与对照药剂露娜森的防 治效果无显著性差异 但显著高于 2 亿孢子 g 木霉菌可湿性粉剂 同时该制剂 500 倍水稀释液对番茄 灰霉病的防治效果为 75 15 与对照药剂露娜森无显著性差异 显著高于 2 亿孢子 g 木霉菌可湿性粉 剂 但该制剂 1000 倍水稀释液对番茄灰霉病的防治效果为 59 32 与 2 亿孢子 g 木霉菌可湿性粉剂 无显著性差异 412 中 国 生 物 防 治 学 报 第 38 卷 表 7 100 亿 CFU g 枯草芽胞杆菌 BAB 1 水分散片剂对黄瓜和番茄灰霉病的防治效果 Table 7 Control efficacy of 10 billion CFU g Bacillus subtilis BAB 1 WT against gray mold on cucumber and tomato 黄瓜灰霉病 Cucumber gray mold 番茄灰霉病 Tomato gray mold 处理 Treatment 病情指数 Disease index 防治效果 Control efficacy 病情指数 Disease index 防治效果 Control efficacy 清水对照 CK 33 75 1 60 a 37 51 4 97 a 露娜森 Lunasen1000 8 76 1 94 c 76 25 5 29 a 6 54 1 50 c 84 85 3 52 a 2 亿孢子 g 木霉菌可湿性粉剂 2 10 8 conidia g Trichoderma WP 500 13 76 1 49 b 62 71 4 04 b 18 15 4 76 b 57 95 12 22 b 100 亿 CFU g 枯草芽胞杆菌水分散片剂 B subtilis BAB 1 WT 1000 7 57 2 53 c 79 48 7 04 a 17 55 1 97 b 59 32 5 46 b 100 亿 CFU g 枯草芽胞杆菌水分散片剂 B subtilis BAB 1 WT 500 5 86 0 75 c 84 11 4 13 a 10 72 0 82 c 75 15 2 78 a 注 数据为平均值 标准误 不同小写字母表示 0 05 水平上差异显著 Note data were presented as mean SD data with different lowercase letters indicated significant difference at 0 05 level 3 讨论 在 农药和化肥 双减的国家战略驱动下 微生物杀菌剂成为植物保护领域中最热门的研发重点之一 但在微生物杀菌剂产业发展过程中仍存在许多问题 其中制剂工艺创新被列为重要关键技术 微生物杀菌 剂制剂优劣及其加工工艺是决定生防菌能否走向市场的关键因素 23 微生物杀菌剂的有效成分为活体生防微生物 因此保证制剂中各种助剂成分不影响有效成分的存活 即生防微生物与助剂生物学相容性 成为微生物杀菌剂制剂创制中关键技术问题 关于生防微生物与助剂 生物学相容性的研究报道较多 李姝江等 23 通过研究发现载体高岭土和白炭黑 润湿剂十二烷基苯磺酸钠 对解淀粉芽胞杆菌 BA 12 的活性影响最小 可以作为可湿性粉剂研发的载体与助剂 程立君等 24 对 4 种稳 定剂和 5 种紫外保护剂进行筛选 确定 CMC Na 糊精和黄原胶对酷绿木霉 TR1 菌丝生长和孢子萌发没有 影响 能够用于木霉可湿性粉剂的研制 明亮等 25 通过筛选载体与助剂 确定了解淀粉芽胞杆菌 B1619 水分散粒剂的最佳配方 而关于制备水分散片剂的助剂筛选研究报道较少 本试验以生物学相容性试验和 正交试验结合 筛选枯草芽胞杆菌 BAB 1 水分散片剂的适宜助剂并确定适宜用量 为该生防微生物菌株的 制剂化提供了丰富的科学数据支撑 前期本实验室以枯草芽胞杆菌 BAB 1 为有效成分 研制了 100 亿 CFU g 枯草芽胞杆菌粉尘剂 该制 剂对番茄灰霉病的室内防效达到 57 14 71 43 对黄瓜灰霉病的室内防效达到 48 80 17 该制剂对黄 瓜灰霉病的防效低于本研究中水分散片剂的防效 虽然粉尘剂能够有效降低棚室内湿度 降低病害发生率 但该制剂在研制及使用过程中会出现粉尘飞扬 易于对环境造成污染 危害人类