沼泽红假单胞菌PSB-06菌剂对番茄褪绿病的防效及其作用机制.pdf

植物保护学报Journalof PlantProtection 2021 48 6 1496 1507 DOI 10 13802 ki zwbhxb 2021 2021905 沼泽红假单胞菌PSB 06 菌剂对番茄褪绿病的防效 及其作用机制 张煜琦 1 刘 勇 2 陈应凤 3 曾 军 4 贺东方 5 方守国 1 1 长江大学农学院 湖北 荆州434025 2 湖南省农业科学院植物保护研究所 长沙410125 3 四川绵阳市绵蔬种业有限 公司 绵 阳621100 4 新 疆 农 业 科 学 院 微 生 物 应 用 研 究 所 乌 鲁 木 齐830091 5 广 东 乾 农 农 业 科 技 发 展 有 限 公 司 广 州510000 摘 要 为 明 确 沼 泽 红 假 单 胞 菌Rhodopseudomonas palustris PSB 06 菌 剂 对 番 茄 褪 绿 病 毒 tomato chlorosisvirus ToCV 的 抑 制 作 用 连 续3 年 在 田 间 进 行 沼 泽 红 假 单 胞 菌PSB 06 菌 剂 对ToCV 的 药 效 试 验 并 在 室 内 研 究 其 抗 病 毒 的 作 用 机 制 田 间 试 验 结 果 显 示 PSB 06 菌 剂 处 理 能 降 低ToCV 的 发 生 植 株 发 病 率 均 低 于50 均 显 著 低 于 清 水 和 氨 基 寡 糖 素 处 理 室 内 试 验 结 果 显 示 PSB 06 菌 剂 处 理 能 抑 制 病 毒 传 播 喷 施PSB 06 菌 剂 后 的 感 病 番 茄 的SA 含 量 达532 67mg g PI II 和NPR1 基 因 表 达 量 也 相 对 上 升 同 时 健 康 番 茄 与 感 病 番 茄 的 叶 绿 素 含 量 均 明 显 升 高 经PSB 06 喷 施 后 番 茄 植 株 上 的 烟 粉 虱Bemisiatabaci 生 存 数 量 降 低 蛋 白 组 学 分 析 结 果 表 明 PSB 06 处 理 促 使 植 物 代 谢 及 防 御 的 相 关 蛋 白 均 上 调 表 明 沼 泽 红 假 单 胞 菌PSB 06 菌 剂 能 增 强 植 物 免 疫 和 防 御 烟 粉 虱 的 能 力 从而有效地控制ToCV 的发生及传播 关键词 番茄褪绿病毒 烟粉虱 沼泽红假单胞菌 蛋白组学 ControlefficacyandmechanismoffungicideRhodopseudomonaspalustrisPSB 06 ontomatochlorosisvirus Zhang Yuqi 1 Liu Yong 2 Chen Yingfeng 3 Zeng Jun 4 He Dongfang 5 Fang Shouguo 1 1 CollegeofAgriculture YantzeUniversity Jingzhou434025 HubeiProvince China 2 HunanInstituteofPlant Protection Changsha410125 HunanProvince China 3 SichuanMianyangMianshuSeedIndustryCo Ltd Mianyang621100 SichuanProvince China 4 InstituteofMicrobiologicalApplications XinjiangAcademy ofAgriculturalSciences Urumqi830091 XinjiangUygurAutonomousRegion China 5 GuangdongQiannong AgriculturalScienceandTechnologyDevelopmentCo Ltd Guangzhou510000 GuangdongProvince China Abstract In order to clarify the inhibitory effect of Rhodopseudomonas palustris PSB 06 on tomato chlorosis virus ToCV the efficacy of fungicide PSB 06 onToCVwas evaluated in field for three con secutive years and its antivirus mechanism was studied in laboratory Field test results showed that the disease index was lower than 50 for PSB 06 treatment which was significantly lower than water and amino oligosaccharide treatments The PSB 06 treatment could inhibit the spread of virus The SAcon tent of infected tomato increased to 532 67 mg g after spraying with PSB 06 compared to less than that in control water treatment the expression levels of PI II and NPR1 genes were also increased and the chlorophyll content increased significantly in both healthy and infected tomatoes after PSB 06 treat ment The number of Bemisia tabaci the vector of ToCV on tomato plants decreased after spraying withPSB 06 ProteomicanalysisshowedthatPSB 06treatmentpromotedtheup regulationofproteinsre latedtometabolismanddefense Theresultsindicatedthat R palustrisPSB 06couldenhancetheability 基 金 项 目 国 家 自 然 科 学 基 金 32030088 财 务 部 和 农 业 农 村 部 国 家 现 代 农 业 产 业 技 术 体 系 CARS 23 D 02 新 疆 农 业 科 学 院 科 技 创 新 重 点 培育专项 xjkcpy 2020005 通信作者 Authorsforcorrespondence E mail haoasliu sg fang 收稿日期 2021 09 066 期 张煜琦等 沼泽红假单胞菌PSB 06 菌剂对番茄褪绿病的防效及其作用机制 1497 of plant immunity and defense against B tabaci thus effectively control the occurrence and transmis sionofToCV Keywords tomatochlorosisvirus ToCV Bemisiatabaci Rhodopseudomonaspalustris proteomic 番 茄 褪 绿 病 毒 tomato chlorosis virus ToCV 属 于 长 线 形 病 毒 科 毛 形 病 毒 属Crinivirus 对 全 世 界 范 围 内 的 番 茄 生 产 及 品 质 造 成 了 严 重 影 响 Duffus et al 1996 在 巴 西 突 尼 斯 等 国 家 均 已 经 发 现 了 ToCV Barbosa et al 2010 Gharsallah et al 2015 ToCV 首 次 发 生 在 我 国 台 湾 省 近 年 来 在20 多 个 省 均 有 报 道 发 病 区 的 发 病 率 高 于50 番 茄 产 量 降 低 60 单 价 降 低50 造 成 了 严 重 的 经 济 损 失 周 涛 等 2014 魏 可 可 等 2018 迄 今 为 止 尚 无 对 ToCV 有高 效抗 性或 耐受 性的 商业 番茄 品种 ToCV 主 要 是 由 烟 粉 虱Bemisia tabaci 传 播 李 娇 娇 等 2018 因此目前防治措施大都是依赖化学防治降低 其介体种群数量来降低病毒扩散 烟粉虱具有抗药 性 强 为 害 性 大 入 侵 性 强 田 间 扩 散 能 力 强 适 应 性 强 等 特 点 对 其 防 控 也 十 分 有 难 度 国 家 进 等 2017 近年来 生物防治因其高效无污染的特点 受到 了 越 来 越 多 的 关 注 找 到 高 效 防 治ToCV 的 生 物 制 剂对我国番茄生产以及农业生态可持续发展都有重 要 意 义 王 杰 和 王 开 运 2011 发 现 香 菇 多 糖 水 剂 可 以 用 于 防 治 水 稻 条 纹 叶 枯 病 烟 草 病 毒 病 及 番 茄 病 毒 病 姚 鑫 2016 发 现 壳 寡 糖 水 剂 可 用 于 辣 椒 疫 病 的 防 治 光 合 细 菌 photosynthetic bacteria PSB 是 一 种 新 型 的 生 物 农 药 能 够 促 进 植 物 生 长 并 防 控 植 物病毒病 吴永强和宋鸿遇 1991 一些研究表明 PSB 的 生 长 与 水 稻 产 量 之 间 存 在 正 相 关 施 用PSB 可 使 谷 物 产 量 提 高21 29 Kobayashi Haque 1971 Harada et al 2005 Zhang et al 2020 发 现 沼 泽 红 假 单 胞 菌Photosynthetic bacteria GJ 22 与 杀 菌剂克露联合使用能对马铃薯晚疫病具有高效防治 作 用 此 外 Zhaietal 2021 报 道GJ 22 对 烟 草 花 叶 病 毒 同 样 有 防 治 效 果 并 且 指 出GJ 22 分 泌 的 胞 外 多糖是其生 物防治能力 的 主 要 有 效 成 分 但 目 前 有 关 沼 泽 红 假 单 胞 菌 对 番 茄 褪 绿 病 毒 病 的 防 效 还 未 报 道 为 了 明 确 沼 泽 红 假 单 胞 菌PSB 06 菌 剂 对ToCV 的 抑 制 作 用 本 研 究 采 用 田 间 和 室 内 试 验 相 结 合 的 方 式 连 续3 年 在 田 间 进 行 沼 泽 红 假 单 胞 菌PSB 06 菌 剂 对ToCV 的 药 效 试 验 并 在 室 内 从 病 毒 传 播 植 物 防 御 激 素 叶 绿 素 烟 粉 虱 行 为 和 生 长 发 育 蛋 白 质 组 学 等 方 面 研 究 其 抗 病 毒 的 作 用 机 制 以 期 为 今后番茄褪绿病毒病的防控提供新的技术和 方向 1 材料与方法 1 1 材料 供 试 作 物 昆 虫 供 试 番 茄 品 种 为 钻 红 美 娜 由 湖 南 省 农 业 科 学 院 蔬 菜 研 究 所 提 供 室 内 供 试 番 茄 种 植 在 直 径15 cm 花 盆 中 置 于 长 宽 高 为60 cm 40cm 80cm 的 养 虫 笼 内 外 面 用 尼 龙 网 包 裹 透 光 性能良好 饲养期间不接触任何农药及昆虫 烟草品 种 为 三 生 烟 由 湖 南 省 农 业 科 学 院 植 物 保 护 研 究 所 提 供 烟 粉 虱 品 种 均 为Q 型 烟 粉 虱 由 中 国 农 业 科 学 院 蔬 菜 花 卉 研 究 所 张 友 军 研 究 员 课 题 组 馈 赠 饲 养 在 番 茄 上 每 隔1 个 月 进 行 烟 粉 虱 生 物 型 鉴 定 罗 晨 等 2002 确 保 试 验 所 用 的 烟 粉 虱 均 为Q 型 烟 粉 虱 供 试 菌 剂 药 剂 沼 泽 红 假 单 胞 菌PSB 06 菌 剂 湖 南 艾 格 里 生 物 有 限 公 司 稀 释500 倍 后 备 用 5 氨 基 寡 糖 素 amino oligosaccharin 海 南 正 业 有 限 公司 稀释500 倍备用 试 剂 及 仪 器 Phanta Max Super Fidelity DNA Polymerase AceQ qPCR SYBR Green Master Mix 试 剂 盒 南 京 诺 唯 赞 生 物 科 技 股 份 有 限 公 司 植 物 RNA 提 取 试 剂 盒 北 京 天 根 生 化 科 技 有 限 公 司 ThermoScientificPierceBCA 试 剂 盒 赛 默 飞 世 尔 科 技 中国 有限公司 茉莉酸和水杨酸标准品 北京华 尔 博 科 技 有 限 责 任 公 司 其 他 试 剂 均 为 国 产 分 析 纯 Mastercycler nexus X2 PCR 扩 增 仪 德 国 艾 本 德 股 份 公 司 compEAct 电 泳 仪 德 国 耶 拿 分 析 仪 器 股 份 公 司 LCMS 8060NX 超 高 效 液 相 色 谱 仪 岛 津 企 业 管 理 中 国 有 限 公 司 Agilent 5977B 串 联 质 谱 仪 安 捷 伦 科 技 中 国 有 限 公 司 CFX384Touch 荧 光 定 量PCR 仪 美 国 伯 乐 公 司 OK Y10 植 物 营 养 测 定 仪 郑州欧柯奇仪器制造有限公司 1 2 方法 1 2 1 ToCV 的防控及调查方法 田间番茄育苗于湖南省农业科学院蔬菜研究所 试 验 基 地 大 棚 内 育 苗 时 间 在2018 年 2019 年 和 2020 年 的3 月 上 旬 待 番 茄 苗 长 至3 4 片 真 叶 将 健 康Q 型 烟 粉 虱 接 种 至 感 染ToCV 烟 草 上 获 毒48 h 后 转移到健康番茄植株上48h 进行传毒 然后移走 全 部 烟 粉 虱 每 天 观 察 及 时 去 除 虫 卵 和 若 虫 接 毒 15 d 后 移 栽 到 大 田 每 垄 宽1 m 长30 m 每 垄 约1498 植 物 保 护 学 报 48 卷 180 株 番 茄 2 株 番 茄 植 株 种 植 间 隔 约30cm 45 d 后 随 机 取 样 调 查 田 间 移 栽 番 茄 的 发 病 情 况 每 年 共 采 集60 片 叶 片 根 据 病 情 分 级 标 准 计 算 病 情 指 数 统 计ToCV 发 病 率 并 从 田 间 试 验 植 株 上 随 机 取 叶 片 带 回 实 验 室 检 测ToCV 以 明 确 田 间 的 实 际 发 病 情 况 病 情 分 级 标 准 为0 9 级 刘 勇 2018 0 级 无 症 状 1 级 轻 度 矮 化 叶 片 面 积 低 于 正 常 叶 面 积 的80 部 分 老 叶 褪 绿 大 部 分 叶 片 不 表 现 症 状 3 级 中 部 叶 片 花 叶 老 叶 褪 绿 数 量 达 到 叶 片 总 数30 株 高 低 于 健 株80 叶 片 面 积 低 于 正 常 叶 面 积70 5 级 中 部 叶 片 花 叶 仅 余 叶 脉 为 绿 色 株 高 低 于 健 株70 叶 片 面 积 低 于 正 常 叶 面 积50 7 级 仅 余 叶 脉 为 绿 色 叶 片 面 积 低 于 正 常 叶 面 积40 叶 片 脆 植 株 明 显 矮 化 株 高 低 于 健 株60 9 级 仅 余 叶 脉 为 绿 色 叶 片 脆 植 株 严 重 矮 化 叶 片 面 积 低 于 正 常 叶 面 积30 株 高 低 于 健 株1 3 经 过 检 测 发 现2018 年 2019 年 及2020 年 发 病 率 均 高 达95 因 此进行了防控药效试验 在 上 述 大 田 中 进 行 防 控 药 效 试 验 设置3 个处 理 清 水 喷 施 PSB 06 菌 剂 喷 施 氨 基 寡 糖 素 喷 施 将 药 剂 于 接 毒 后1 3d 初 花 期 每 株1 2 个 花 蕾 盛 花 期 每 株 有4 5 朵 盛 开 的 花 分 别 喷 施1 次 共 计 喷 施 3 次 第1 次 平 均 每 株 喷 施 药 液15 20 mL 第2 次 平 均 每 株 喷 施 药 液80 100 mL 第3 次 平 均 每 株 喷 施 药 液150 200 mL 每 垄 为1 个 小 区 重 复4 次 各 小 区 随 机 分 布 每 个 小 区 随 机 调 查6 个 点 每 点 查 10 株 每 个 小 区 共 调 查60 株 以 株 为 单 位 记 录 调 查 总 株 数 各 级 病 株 数 或 明 显 枯 萎 死 亡 的 植 株 发 病 率 发 病 株 数 调 查 株 数 100 病 情 指 数 发 病 株 数 该 病 等 级 值 调 查 总 株 数 最 高 等 级 值 100 相 对 防 效 对 照 病 情 指 数 处 理 病 情 指 数 对 照病情指数 100 1 2 2 ToCV 的检测 参 照 植 物RNA 提 取 试 剂 盒 操 作 说 明 提 取 试 验 田 间 采 集 的 番 茄 叶 片 的 总RNA 反 转 录 合 成 第 一 链 cDNA 使 用 的ToCV HSP70 基 因 特 异 性 引 物ToCV 3R 5 AAACTGCCTGCATGAAAAGTCTC 3 和 ToCV 3F 5 GGTTTGGATTTTGGTACTACATTCA GT 3 进 行PCR 反 应 所 有 引 物 均 由 生 工 生 物 工 程 上 海 股 份 有 限 公 司 合 成 50 mL 反 应 体 系 cDNA 2 mL 上 下 游 引 物 各2 mL dNTPs Mix 1 mL Phanta Max Super Fidelity DNAPolymerase 1 mL 2 Phanta Max Buffera 25 mL ddH 2 O 17 mL PCR 反 应 程 序 95 预 变 性5 min 95 变 性30 s 60 退 火45 s 72 延 伸1 min 循 环30 个 72 延 伸10 min PCR 扩增产物进行2 0 琼脂糖凝胶电泳检测并拍照 1 2 3 PSB 06 处 理 对 嫁 接 番 茄 中ToCV 表 达 量 的 影 响 采 用 贴 接 法 进 行 嫁 接 传 毒 从 感 染ToCV 的 番 茄 植 株 上 取 含 韧 皮 部 组 织 的 茎 段 分 别 嫁 接 至30 株 健 康 番 茄 幼 苗 上 将 健 康 番 茄 的 茎 段 嫁 接 至 健 康 番 茄幼苗上作对照 经检测嫁接成功后分别对嫁接番 茄 的 叶 片 喷 施PSB 06 菌 剂 和 清 水 对 照 每 株 番 茄 均 匀 喷 施 至 叶 片 均 匀 铺 满1 2mL 菌 剂 或 清 水 且 无 水 滴 滴 下 共 喷 施3 次 每 隔7d 喷 施1 次 分 别 在 喷 施22 23 25 28 d 时 取0 2 0 3 g 嫁 接 后 番 茄 顶 端 的 叶 片 按1 2 2 中 方 法 提 取RNA 反 转 录 合 成cD NA 以Actin 和UBI 作 为 内 参 基 因 引 物 为Actin F 5 GGAAAAGCTTGCCTATGTGG 3 Actin R 5 CCTGCAGCTTCCATACCAAT 3 和 UBI F 5 TC GTAAGG AGTGCCCTAATGCTGA 3 UBI R 5 CAATCGCCTCCAGCCTTGTTGTAA 3 以 cD NA 为 模 板 引 物ToCV 2F 5 ATGGAGAACAGT GCCGTTGC 3 ToCV 2R 5 TTAGCAACCAGTT ATCGATGC 3 进 行 实 时 荧 光 定 量PCR quantita tive real time PCR RT qPCR 测 定 25 L 体 系 AceQ qPCR SYBR Green Master Mix 12 5 L 正 反 向 引 物 各0 75 L cDNA1 0 L 加ddH 2 O 补 充 至 25 L RT qPCR 扩 增 程 序 95 预 变 性5min 95 变 性10s 60 退 火40s 40 个 循 环 然 后PCR 产 物 加 热 至95 维 持15 s 冷 却 至60 维 持1 min 再 加 热 至95 维 持30s 最 后 降 温 至60 维 持15s 以 此 测 定 熔 解 曲 线 以 不 加 模 板cDNA 的 扩 增 反 应 作 阴 性 对 照 每 个 样 品 至 少3 次 技 术 重 复 3 次 生 物 重 复 反 应 结 束 后 采 集 目 的 基 因 和 内 参 基 因 的Ct 值 使 用 2 Ct 法 计 算 目 的 基 因 的 相 对 表 达 水 平 每 个 处 理 检测9 株番茄 1 2 4 对植物激素含量及基因表达量的影响 取 健 康 和 感 染ToCV20d 的 番 茄 植 株 各9 株 分 别 喷 施 约1 2 mLPSB 06 菌 剂 和 清 水 对 照 以 喷 施 的 时 间 记 为0 d 分 别 取 喷 施1 6 d 后 的 健 康 和 感 染ToCV 的 番 茄 植 株 上 部 分 叶 片 为 样 品 进 行RT qP CR 反 应 检 测 茉 莉 酸 jasmonic acid JA 水 杨 酸 salicylic acid SA 下 游 基 因 PI II F 5 CCTATTCAAGATGTCCCCGTTC 3 R 5 GGGCA ATCCAGAAGATGG 3 和 NPR1 F 5 ATATAG AATTCCTGCTCCAAAGGATCGGTTA 3 R 5 AT ATACTCGAGCAGACAAGTCATCAGCATCCA 3 6 期 张煜琦等 沼泽红假单胞菌PSB 06 菌剂对番茄褪绿病的防效及其作用机制 1499 的 基 因 表 达 量 变 化 反 应 程 序 和 体 系 同1 2 3 每 个 处 理 重 复3 次 根据基因表达量变化趋势 选取喷施2d 后的叶 片 提 取 植 物 激 素 并 用 超 高 效 液 相 色 谱 和 串 联 质 谱 进 行 分 析 每 个 处 理 重 复3 次 基 于 植 物 激 素JA 和 SA 标准品构 建MWDB Metwaredatabase 植物激素 数 据 库 对 质 谱 检 测 的 数 据 进 行 定 性 分 析 利 用 三 重 四 级 杆 质 谱 的 多 反 应 监 测 模 式 multiple reaction monitoring MRM 分 析 获 得 不 同 样 本 的 激 素 质 谱 分 析 数 据 后 对 所 有 目 标 物 的 色 谱 峰 进 行 积 分 通 过 内 标 法 进 行 定 量 分 析 1 2 5 PSB 06 菌剂对番茄叶绿素含量的影响 分 别 取 健 康 和 感 染ToCV 20 d 的 番 茄 植 株 各 9 株 分 别 喷 施1 2 mLPSB 06 菌 剂 和 清 水 对 照 以 喷 施 的 时 间 记 为0 d 分 别 取 喷 施1 6 d 后 的 健 康 和 感 染ToCV 的 番 茄 植 株 上 部 分 叶 片 为 样 品 使 用 叶绿素测定仪检测番茄植株体内叶绿素的变化 先 进 行 校 准 压 头 不 夹 样 品 2 个LED 灯 依 次 发 光 被 接 收 的 光 转 换 成 电 信 号 计 算 光 强 度 的 比 率 然 后 进 行 测 量 压 头 夹 住 样 品 叶 片 后 2 个LED 灯 再 次 发 光 通过叶片传输的光打到接收器上 被转换成电信 号 计 算 传 输 光 的 强 度 比 率 计 算SPAD 测 量 值 表 示夹住的样品叶片当前叶绿素相对含量 1 2 6 PSB 06 处理对烟粉虱选择性的影响 分 别 对1 株 感 染ToCV20d 的 番 茄 植 株 喷 施1 2 mL 的PSB 06 菌 剂 和 清 水 对 照 放 入 长60cm 宽 40cm 高80 cm 的 养 虫 笼 中 两 者 间 隔20 cm 每 个 养 虫 笼 为1 个 重 复 重 复9 次 将 装 有 约100 头Q 型 烟 粉 虱 的 离 心 管 放 入 养 虫 笼 的 中 间 部 位 离 心 管 距 2 株 带 毒 番 茄 植 株 的 距 离 相 等 约10cm 打 开 离 心 管 的 盖 子 让 烟 粉 虱 自 由 爬 出 离 心 管 选 择 分 别 于 24 48 和72 h 后 调 查 每 株 植 株 上 烟 粉 虱 的 数 量 调 查时在温室微弱的光线下进行 防止烟粉虱的逃逸 1 2 7 PSB 06 处 理 对 烟 粉 虱 产 卵 率 及 生 存 情 况 的 影 响 PSB 06 菌 剂 和 清 水 对 照 分 别 喷 施3 株 感 染 ToCV20 d 的 番 茄 植 株 每 株 喷 施1 2 mL 喷 施3 d 后 放 入 养 虫 笼 中 每 株 番 茄 选 取5 片 叶 片 在 叶 片 上 放 置 直 径5cm 微 虫 笼 在 每 个 微 虫 笼 中 装20 头 经2h 饥 饿 处 理 的 烟 粉 虱 每 株 番 茄 植 物 为1 个 重 复 重 复3 次 记 录 喷 施 后 第3 4 5 6 天 烟 粉 虱 的 数 量 记 录 生 存 情况 PSB 06 菌剂 和清 水 对照 分别 喷施3 株感 染 ToCV 的 番 茄 植 株 每 株 喷 施1 2 mL 3 d 后 放 入 养 虫 笼 中 在 叶 片 微 虫 笼 中 放 入20 头 羽 化 第3 天 的 烟 粉 虱 记 录 喷 施 后 第3 6 天叶片上的产卵量 1 2 8 PSB 06 菌 剂 处 理 后 番 茄 植 株 的 蛋 白 组 学 分 析 对 不 同 处 理 后 的 番 茄 植 株 进 行 蛋 白 组 学 分 析 共 设4 个 处 理 健 康 番 茄 喷 施 清 水 健 康 番 茄 喷 施 PSB 06 菌 剂 感 染ToCV 番 茄 喷 施 清 水 和 感 染ToCV 番茄喷施PSB 06 菌剂 每个处理重复3 次 喷 施3 d 后 提 取 各 处 理 番 茄 样 品 的 总 蛋 白 使 用Thermo Scientific Pierce BCA 试 剂 盒 进 行 蛋 白 定 量 使 用BCA 试 剂 盒 配 制BCA 工 作 液 和 不 同 质 量 浓 度 的 标 准 蛋 白 质 溶 液 各 样 品 均 取 2 L 和 ddH 2 O 18 L 混 合 加 入200 LBCA 工 作 液 振 荡 混 匀 37 反 应30 min 在562 nm 处 读 取 吸 光 度 取 蛋 白 样 品100 g 用 蛋 白 裂 解 液 补 充 到90 L 将 样 品 送 至 上 海 美 吉 生 物 医 药 科 技 有 限 公 司 采 用 同 位 素 标 记 相 对 和 绝 对 定 量 isobaric tags for relative andabsolutequantitation iTRAQ 技 术 进 行 分 析 将 差 异 阈 值 设 为 1 2 倍 或 0 83 倍 筛 选 差 异 蛋 白 选 择GO http ge neontology org 对 差 异 蛋 白 进 行 功 能 聚 类 分 析 采 用KEGG http www genome jp kegg 通 路 数 据 库 对差异蛋白涉及的代谢通路进行分析 1 3 数据分析 试 验 使 用SPSS20 0 进 行 统 计 分 析 使 用 单 因 素 方 差 分 析 使 用 独 立 样 本t 检 验 法 和LSD 法 进 行 差 异显著性检验 2 结果与分析 2 1 PSB 06 菌剂对ToCV 的防效 2018 2020 的 数 据 表 明PSB 06 菌 剂 对ToCV 的 相 对 防 效 较 好 分 别 为 82 46 74 47 和 76 46 高 于 氨 基 寡 糖 素 的 相 对 防 效 分 别 为 42 44 48 23 和45 75 图1 A 2018 2020 清 水 处 理 的 发 病 率 最 高 分 别 为 99 47 99 58 和99 65 氨 基 寡 糖 素 处 理 的 发 病 率 分 别 为70 63 68 01 和61 45 PSB 06 菌 剂 处 理 的 发 病 率 最 低 分 别 为 47 41 42 33 和 47 03 PSB 06 处 理 的 发 病 率 显 著 低 于 其 他2 个 处理 图1 B 2018 2020 的 病 情 指 数 结 果 表 明 清 水 处 理 的 平 均 病 情 指 数 最 高 分 别 为59 05 56 94 和50 67 5 氨 基 寡 糖 素 处 理 的 平 均 病 情 指 数 分 别 为33 99 29 47 和27 49 PSB 06 菌 剂 处 理 的 平 均 病 情 指 数 最 低 分别为10 41 14 54 和11 93 图1 C 2 2 PSB 06 处理对嫁接番茄中的病毒传播的影响 结 果 表 明 经PSB 06 菌 剂 喷 施3 次 后 在 第22 1500 植 物 保 护 学 报 48 卷 23 25 和28 天 嫁 接 带 毒 番 茄 植 株 中 的 病 毒 相 对 含 量始终显著低于清水处理的嫁接带毒番茄植株中的 病毒相对含量 且在处理23d 达到最高带毒量 随后 病毒量逐渐降低 图1 2018 2020 年不同处理的ToCV 发病情况指标 Fig 1Incidencereferenceindexofdifferenttreatmentsin2018 2020 图 中 数 据 为 平 均 数 标 准 差 同 年 不 同 小 写 字 母 表 示 经t 检 验 法 检 验 在P 0 05 水 平 差 异 显 著 Datearemean SD Differ entlowercaselettersindicatesignificantdifferenceatP 0 05levelbyttest 2 3 PSB 06 菌剂处理对番茄和烟粉虱的影响 2 3 1 PSB 06 菌 剂 处 理 后 对 番 茄JA 和SA 含 量 的 影 响 在 健 康 植 物 中 番 茄 叶 片 中 的JA 含 量 约 为 71 87 mg g 喷 施PSB 06 菌 剂 后 番 茄 叶 片 中 的JA 含 量 较 对 照 升 高 为104 33mg g 在 感 染ToCV 的 番 茄 叶 片 中 番 茄 叶 片 中 的JA 含 量 约 为92 27 mg g 喷 施PSB 06 菌 剂 后 JA 含 量 为95 10mg g 图2 A 无 论 是 健 康 还 是 感 病 番 茄 喷 施PSB 06 菌 剂 后 番 茄 叶 片 中 的JA 含 量 均 较 对 照 升 高 图2 B 喷 施 PSB 06 菌 剂 后 的 感 病 番 茄SA 的 含 量 达532 67mg g Water H 健 康 番 茄 喷 施 清 水 Water V 感 染ToCV 番 茄 喷 施 清 水 PSB H 健 康 番 茄 喷 施PSB 06 菌 剂 PSB V 感 染 ToCV 番 茄 喷 施PSB 06 菌 剂 Water H Healthytomatosprayedbywater Water V ToCV infectedsprayedbywater PSB H healthytomatosprayedbyPSB 06 PSB V ToCV infectedsprayedbyPSB 06 图2 不同处理的植物激素JA A 和SA B 含量 Fig 2 ContentsofplanthormonesJA A andSA B intomatoleavesafterdifferenttreatments 图 中 数 据 为 平 均 数 标 准 差 不 同 小 写 字 母 表 示 经LSD 法 检 验 在P 0 05 水 平 差 异 显 著 Date are mean SD Different lowercaselettersindicatesignificantdifferenceatP 0 05levelbyLSDtest 2 3 2 PSB 06 菌剂对基因表达量的影响 结 果 表 明 在 感 病 番 茄 中 NPR1 的 表 达 量 高 于 对 照 在1 6d 内 逐 渐 升 高 在 第2 天 表 达 量 最 低 图 3 A PI II 的 表 达 量 要 低 于 对 照 在1 6d 内PI II 表 达 量 逐 渐 降 低 在 第2 天PI II 表 达 量 最 高 图3 B 在 健 康 番 茄 中 NPR1 表 达 量 高 于 对 照 在1 6 d 内 NPR1 表 达 量 逐 渐 升 高 图3 C PI II 表 达 量 低 于 对 照 在1 6d 内 PIII 表达量逐渐升高 图3 D 2 3 3 PSB 06 菌剂对番茄叶绿素含量的影响 在 健 康 番 茄 中 使 用PSB 06 菌 剂 后 番 茄 叶 片 中 的 叶 绿 素 含 量 相 比 对 照 均 有 显 著 提 升 图4 A 在 感 染ToCV 番 茄 中 使 用PSB 06 菌 剂 后 番 茄 叶 片中的叶绿素含量相比对照同样有明显提升 不同 于 健 康 番 茄 在 感 染ToCV 番 茄 中 叶 片 中 叶 绿 素 含 量随着时间的增长呈下降趋势 图4 B 6 期 张煜琦等 沼泽红假单胞菌PSB 06 菌剂对番茄褪绿病的防效及其作用机制 1501 图3 感病番茄 A B 和健康番茄 C D 不同处理下植物激素相关基因表达量 Fig 3 TherelativegeneexpressionofplanthormonesinToCV infectedplants A B andhealthyplants C D afterdifferenttreatments 图 中 数 据 为 平 均 数 标 准 差 不 同 小 写 字 母 表 示 经LSD 法 检 验 在P 0 05 水 平 差 异 显 著 Date are mean SD Different lowercaselettersindicatesignificantdifferenceatP 0 05levelbyLSDtest 图4 PSB 06 对健康番茄 A 感病番茄 B 叶绿素含量的影响 Fig 4 EffectsofPSB 06treatmentonchlorophyllofhealthyplants A andToCV infectedplants B 图 中 数 据 为 平 均 数 标 准 差 不 同 小 写 字 母 表 示 经LSD 法 检 验 在P 0 05 水 平 差 异 显 著 Date are mean SD Different lowercaselettersindicatesignificantdifferenceatP 0 05levelbyLSDtest 2 3 4 PSB 06 处理对烟粉虱选择性的影响 在24 72h Q 型 烟 粉 虱 均 偏 好 取 食 清 水 处 理 的 番 茄 植 株 PSB 06 菌 剂 处 理 对 烟 粉 虱 有 显 著 的 驱 避 作用 图5 2 3 5 PSB 06 处理对烟粉虱产卵及生存的影响 PSB 06 处 理 后 的 番 茄 植 株 上 烟 粉 虱 的 产 卵 数 量 受 到 一 定 影 响 在 第3 天 最 为 明 显 第5 天 往 后 与 对 照 之 间 无 显 著 差 异