芽胞杆菌BvR001对大丽轮枝菌抑制效果研究.pdf

收稿日期 修订日期 基金项目 国家重点研发计划 国家自然科学基金 中国农业科学院基本科 研业务费专项 通信作者 芽胞杆菌 对大丽轮枝菌抑制效果研究 纪晓彬 王 丹 刘 政 李 冉 宋 健 张丹丹 陈捷胤 戴小枫 林克剑 石河子大学农学院 新疆绿洲农业病虫害治理与植保资源利用重点实验室 石河子 中国农业科学院植物保护研究所 北京 新疆农垦科学院植物保护研究所 石河子 摘要 为研发绿色 安全 高效的作物黄萎病生物防治产品 本研究以生防菌株 为研究对象 通过对黄萎病 菌的抑菌效果测定 可湿性粉剂研制 在寄主根际的定殖能力与防效测定 明确该菌株对黄萎病具有防控效果 序列检测和系统发育树构建分析表明 该菌株属于芽胞杆菌属 并且与贝莱斯芽胞杆菌 进 化关系最近 推测其可能是贝莱斯芽胞杆菌 平板对峙试验表明 该菌对 种基因型 落叶型和非落叶型 大丽轮枝 菌 和 菌落扩展的抑制率分别为 和 研发了该菌的可湿性粉剂配方 吸附量 为 的发酵液 硅藻土母粉 十二烷基磺酸钠 木质素磺酸钠 羧甲基纤维素钠 维生素 该配方得到的制剂活芽胞量为 润湿时间 悬浮率为 杂菌率为 细度通过率 干燥减量 利用烟草和棉花测试发现 该菌剂对寄主植物安全无毒 且 能有效定殖于寄主根际 显著降低了黄萎病菌繁殖扩展 对黄萎病具有良好的防效 关键词 芽胞杆菌 可湿性粉剂 黄萎病 生物防治 中图分类号 文献标识码 卷第 期 纪晓彬等 芽胞杆菌 对大丽轮枝菌抑制效果研究 黄 萎 病 是 由 大 丽 轮 枝 菌 引起的典型土传维管束真菌病害 严重威胁 农作物生产安全 大丽轮枝菌寄主范围十分广泛 在我国自然病圃和人工病圃中大丽轮枝菌可感染 科 多 种 植 物 除 棉 花 外 茄 科 豆 科 葫 芦 科 菊科 唇 形 科 和 苋 科 等 科 的 多 种 植 物 亦 可 受 害 每年给农业生产带来巨大损失 黄萎病对 棉花生产造成的危害尤为严重 是棉花生产上的头 号病害 受害棉株叶片变黄枯萎 蕾铃脱落 棉铃 变少 一般减产 左右 重者达 以上 化 学农药是防控黄萎病的有效方法之一 但化学药剂 防治存在环境污染 残留 病原抗药性等问题 因 此开发人畜无害 对环境友好的微生物制剂对黄萎 病防控具有重要意义 目前 已发现多种生防菌对大丽轮枝菌具有良好 的抑制作用 如特基拉芽胞杆菌 对马铃薯黄萎病的防效可达到 以上 室 内防效试验显示 多黏类芽胞杆菌 能够延迟病害的发生 同时对棉花具有一 定的促生作用 解淀粉芽胞杆菌 对作物黄萎病具有良好的防效 还 有一些内生真菌对大丽轮枝菌具有拮抗作用 研究较 多的是木霉属 如哈茨木霉 绿色木霉 棘孢木霉 等均能够 有效防治黄萎病菌对番茄 橄榄等的危害 并伴有促 生作用 此外 有研究发现 一些非致病性镰刀 菌对大丽轮枝菌有一定的抑制作用 比如尖镰孢 能够在茄子根茎有效定 殖 并能减少大丽轮枝菌在根部的定殖 从而减轻黄 萎病的发生 目前也有一些生防菌制备成可湿性 粉剂被应用于生产实践 如芽胞杆菌 的生防制剂拌土后能有效降低茄子黄萎病 的发病症状 枯草芽胞杆菌 在棉 花 向日葵等作物黄萎病的防控上也取得了显著的效 果 此外 有研究表明 由于自然环境的多样性 及复杂性 多种生防菌按一定比例混合使用 能够起到 比单独使用一种生防菌更好的效果 如特基拉芽 胞杆菌 和鞘氨醇杆菌 复 配使用不仅能够高效抑制黄萎病菌的生长 还能激 活寄主植物的防御反应 从而显著提高寄主棉花对 大丽轮枝菌的抗性 我国黄萎病危害尤为严重 特别是近年农业种 植结构调整加剧了黄萎病病原的变异 亟须筛选新 的对黄萎病具有防控效果的生防菌株并进行防控效 果评价 为最终在生产上防控黄萎病提供理论和数 据支撑 为此 本研究以分离自棉花 可显著抑制大 丽轮枝菌生长的生防菌株 为研究对象 通 过对不同基因型 落叶型和非落叶型 大丽轮枝菌的 抑菌效果测定 可湿性粉剂的制备以及制剂对烟草 和棉花黄萎病的抑制效果测定等试验 评价该菌株 制剂对黄萎病的防效 为该菌剂后期配方优化及在 黄萎病防治中的推广应用提供科学依据 材料和方法 材料 供试菌株 供试的大丽轮枝菌包括两种基因型 分别为强致病力落叶型 本实验室保存 和中 等致病力非落叶型 来自中国农业科学院棉 花研究所 芽胞杆菌 分离自新疆黄萎病 棉田生长正常的棉株 供试培养基 马铃薯葡萄糖琼脂培养基 培养基 试剂 硅藻土 中位粒径 十二烷基磺 酸钠 木质素磺酸钠 羧甲基纤维素钠 维生素 植 物 快 速 提 取 试 剂 盒 原 平 皓 北 京 全式 金 北京 主要仪器 鼓风式干燥机 气流粉碎机 供试寄主植物 烟草 棉花 品种为 军棉 号 均选取长势 一致 状态良好 生长 周的幼苗作为测试对象 微生物培养 将 保存的 划线于 固体培养 基上 培养活化 挑取单菌落接种于 液体培 养基 过夜培养作为种子液 再以 的接种量转接于新鲜的 液 体 培 养 基 中 条件下培养 得到发酵液 分别取 保存于 的大丽轮枝菌 和 接种于 固体培养基上 恒温培养 挑取菌落接种于完全液体培养基 酵母提取物 酸水解酪蛋白 蔗 糖 中 培养 过滤收集 孢子 并将孢子浓度调至 个 备用 菌株 分子鉴定 通过 扩增 基因序列 扩增引物序列如下 扩增体系为 模板 基因 序列通用简并引物各 扩增条件 预变性 变性 退火 延伸 共 次循环 最后 延伸 菌株 抑菌活性测定 采用 打孔器打取大丽轮枝菌 和 菌饼 置于 的 平板中心 恒温培养 在距离菌落边缘 处接种芽胞 杆菌 于 恒温继续培养 观察菌落 生长情况 测量大丽轮枝菌菌落直径以及生防菌菌 落边缘与大丽轮枝菌菌落边缘的垂直距离 即抑菌 带距离 计算生防菌 对 和 菌落扩展的抑制率 计算公式如下 抑菌率 抑菌带距离 对照菌落半径 对照菌落半径 生防菌 可湿性粉剂制备 将种子液以 的量加入新鲜 液体培养基 中 条件下培养 得到发酵液 向 载体硅藻土中添加 发酵液 直至硅 藻土完全湿润不再吸附 将得到的混合物鼓风干燥 后经气流粉碎 得到吸附量为 的母粉 向 母粉中添加不同比例的润湿剂 十二烷基磺酸钠 木 质素磺酸钠 分散剂 羧甲基纤维素钠 等助剂混匀 后经气流粉碎机粉碎 得到可湿性粉剂 可湿性粉剂质量检测 制剂中活芽胞含量参照 中 描述的方法 润湿时间参照国标 中的方法测定 悬浮率参照国标 中的方法测定 杂菌率参照 中的 方法测定 值按国标 中的方法测 定 细度按国标 中的方法测定 干 燥减量参照 中的方法测定 可湿性粉剂活性测定 称取 可湿性粉剂 溶于 无菌水中 混匀配制成粉剂悬液备用 同时 以商业化芽胞杆菌可湿性粉剂 作为对照 选取长势一致的健康烟草幼苗以及棉花幼苗若干 均分成 组 每组 悬液 处理 接种浓度为 个 的 孢子悬浮液 处理 先浇灌商 业化可湿性粉剂 悬液 后再次接种 个 的 孢子悬浮液 处理 只浇灌商业化 可湿性粉剂 悬液 作为处理 的对照 处理 为先浇灌可湿性粉剂 后再次接种 个 的 孢子悬浮液 处理 只浇灌可 湿性粉剂 悬液 作为处理 的对照 剩 余一组作为空白对照 只定期浇水 接种 后进行病情观察 使用苗期 级分级法进行调 查 级 植株未表现出黄萎病症状 级 片子 叶出现轻微黄萎病症状 级 片真叶出现轻微黄 萎病病症 级 片及以上真叶出现明显病症 级 整株出现严重黄萎病病症或枯死 病情指数 各级病株数 该病级值 调查 总株数 最高级值 烟草和棉花茎基部大丽轮枝菌定殖检测 分别取各处理烟草 棉花的茎基部 根茎结合部 位 表面清洗干净后剪碎混匀 液氮速冻后保存于 备用 各处理取 的根茎结合部组织并提 取基因组 将各样品 浓度调至 分别以烟草 棉花管家基因 为内参基 因 大丽轮枝菌的延伸因子 作为靶标基 因 通过定量 检测大丽轮枝菌靶标基因 的相对值 即大丽轮枝菌的相对含量 定 量引物序列见表 表 烟草和棉花根茎部位大丽轮枝菌定量检测引物 引物名称 序列 反应 体 系 模 板 引 物 各 烟草根部生防菌 的测定 以烟草根际生防菌定殖检测为例 分别取各处 理烟草的根部 表面消毒后剪碎混匀 分别称取 各处理的根部组织 加 无菌水研磨 滤掉植 卷第 期 纪晓彬等 芽胞杆菌 对大丽轮枝菌抑制效果研究 物碎渣 取 上 清 液 进 行 梯 度 稀 释 涂 板 次 日 统 计 菌落数 数据处理 应用 构建系统发育树 采用 软件对试验数据进行方差分析 采用 及 作图 结果与分析 菌株 的 序列分析 通过 扩增获得 的 基因序列长 度为 将该序列在 进行 比对 结果显示其与贝莱斯芽胞杆菌 的 序列一致性达 选取大肠杆菌 的 基因序列 为外群 利用 软件 采用邻接法 构建系统发育 树 结果表明 菌株 与贝莱斯芽胞杆菌聚在 一个分支 图 以上结果表明 该生防菌株属于芽胞 杆菌属 并且与贝莱斯芽胞杆菌进化关系最近 推测 其可能是贝莱斯芽胞杆菌 图 基于 基因序列构建菌株 的系统发育树 菌株 抑菌活性测定 平板抑菌结果表明 对 种基因型大丽 轮枝菌 强致病力落叶型 和中等致病力非落 叶型 的菌落扩展均有显著的抑制作用 图 进一步通过测量抑菌带距离 统计结果发现 对大 丽 轮 枝 菌 有 显 著 的 抑 制 作 用 图 计算得到生防菌 对 和 菌落扩展的抑制率分别可达 和 可湿性粉剂制备及质量检测 对添加不同比例的十二烷基磺酸钠 木质素磺 酸钠 羧甲基纤维素钠及维生素 的母粉的润湿性 及悬浮率进行测定 结果表明 芽胞杆菌 可 湿性粉剂 优化制备方法为 向载体硅 藻土中添加摇瓶发酵液直至硅藻土完全湿润不再吸 附 将得到的混合物鼓风干燥后经气流粉碎得到母 粉 再加入助剂十二烷基磺酸钠 木质素磺酸钠 羧甲基纤维素钠 以及紫外保护剂维生素 经气流粉碎机混合均匀 该配方得到的制剂活 芽胞量为 润湿时间 悬浮率为 杂菌率为 值为 细度通 过率 干燥减量 表 图 对大丽轮枝菌的抑制效果检测 表 可湿性粉剂 质量检测 指标名称 润湿时间 悬浮率 杂菌率 细度 干燥减量 国家标准值 实际测定值 可湿性粉剂活性测定 以烟草和棉花为测试对象对可湿性粉剂 对黄萎病的防效进行测定 结果显示 单独 接种 的处理组烟草植株弱小 株高增长缓慢 或停滞 叶片发黄枯萎至死亡 茎基部剖面图显示茎 基部维管束褐化 呈现出典型的黄萎病症状 生防菌 剂 及商业化生防菌剂 两组处理下烟草的长势良好 和空白对照 组基本一致 表现出良好的黄萎病防控效果 单独接 种生防菌剂 的烟草长势正常 茎基部维 管束未见褐化 图 和 对棉花黄萎病的防效 也得到类似结果 与商业化生防菌剂 相似 图 可湿性粉剂对烟草和棉花黄萎病的防治效果检测 卷第 期 纪晓彬等 芽胞杆菌 对大丽轮枝菌抑制效果研究 可湿性粉剂 预处理的棉花幼苗对大丽轮 枝菌表现出良好抗性 叶片黄化脱落明显减轻 维管 束褐化得到缓解 图 和 说明 对黄 萎病的防效与商业化菌剂 相当 对不同处理条件下烟草和棉花的发病情况进行 统计 结果显示 生防菌剂 及 商业化生防菌剂 两组处理下烟草 和棉花的病情指数与单独接种 相比 具有显 著性差异 进一步说明生防菌剂 对黄萎病具有良好的防效 表 表 不同处理下烟草和棉花发病的病情指数 处理 病情指数 烟草 棉花 对照 同列不同小写字母表示差异显著 检 验法 烟草和棉花茎基部大丽轮枝菌定殖检测 采用 检 测 大 丽 轮 枝 菌 靶 基 因 在烟草和 棉花茎基部的相对拷贝数 并以此表示大丽轮枝菌 在寄主根部的生物量 进一步明确可湿性粉剂 对黄萎 病 的 防 效 结 果 表 明 单 独 接 种大丽轮枝菌 的烟草茎基部中 的生 物量显著高于同时接种生防菌剂 和 和大丽轮枝菌的试验组 其中 单独接种 的烟草茎基部菌体生物量分别是 经商业化生防菌剂 和本试验可湿性粉剂 处理后的 倍和 倍 图 对棉 花的测试结果类似 单独接种 的棉花茎基 部的生物量显著高于 以及 处理的棉花 分别为 倍 和 倍 图 上述结果说明可湿性粉剂 能够有效防止大丽轮枝菌在烟草和棉花茎 基部的定殖 进而达到防控黄萎病的作用 同时 上述结果也显示可湿性粉剂 对烟草和 棉花黄萎病具有和商业化生防菌剂 相当 的防效 图 可湿性粉剂 处理后烟草和棉花茎基部大丽轮枝菌 繁殖量检测 烟草与棉花根部组织生防菌 定殖 检测 以烟草与棉花为例对生防菌 在根部定 殖情况进行检测 通过稀释涂板法 统计不同处理 烟草和棉花根部组织内生防菌 定殖情况 结果显示 与商业化生防菌剂 类似 单独 接种可湿性粉剂 和既接种可湿性粉剂 又接种病原菌的处理 烟草 和 棉 花 根 部内生的生防菌菌落数没有明显差异 菌落数均在 左右 随机挑选平板中菌落进行测序分 析 结果显示测序菌落均为生防菌 这一结 果表明可湿性粉剂 能够有效定殖于烟 草和棉花根系 并且病原菌对生防菌的定殖也没有 显著影响 图 图 烟草与棉花根部 生防菌的检测 讨论 芽胞杆菌属的不同种之间亲缘关系极为相近 序列很难区分 比如苏云金杆菌 和蜡样芽胞杆菌 的 序列仅有几个碱基的差异 而 基因进 化速率快且不发生水平转移 有较好的分辨率 本试验利用该基因序列对芽胞杆菌 进行分 类鉴定 可初步将其与其他芽胞杆菌区分开 通过系 统发育树分析推断本研究的芽胞杆菌 为贝 莱斯芽胞杆菌 关于该菌株准确的种属分类尚需进 一步的分子验证 本研究还 通 过 平 板 对 峙 试 验 检 测 了 对不同基因型大丽轮枝菌 和 菌落 生长的抑制效果 结果表明 具有潜在的防 控黄萎病应用价值 可湿性粉剂是微生物农药中 的主要剂型 该剂型生产成本低 应用范围广 有 研究表明在可湿性粉剂研制过程中气流粉碎的方 法对活芽胞含量的影响十分微小 增加粉剂细度则 更有利于吸收粉剂 大大缩短润湿时间 提高悬浮 率 本试验也采取气流粉碎方法对各组分进行 混合 最 终 制 剂 细 度 为 几 乎 完 全 通 过 筛选筛 润湿时间也大大缩短 初步得到的 生 防 菌 剂 的 活 芽 胞 数 为 后续研究为了在实际应用中达到低剂 量 高防 效 的 目 的 还 需 进 一 步 提 高 制 剂 活 芽 胞 数 例如可以对 菌株发酵条件进行优化 筛选该菌株最佳发酵条件 如研制生防菌 可湿性粉剂时首先对其发酵条件进行了优化 通过 筛选 得 到 菌 量 为 亿 芽 胞 杆 菌 的 菌 量 为后期得到更多生物量的生防菌剂提供了 基础保 障 对 各项指标进行测定发 现 除悬浮率偏低外 悬浮率为 低于国标 值 其余各指标均符合国标值 针对悬浮 率不足问题 后期应进一步选择多种助剂进行筛 选 尤其是对分散剂的选择 本研究以烟草及棉花幼苗为测试植物 对初步 得到的可湿性粉剂 对黄萎病的防效进 行了测定 单独接种生防菌剂 的烟草 和棉花均能正常生长 茎基部维管束未见褐化 说 明该生防菌对植物安全无毒 为进一步确定其对人 畜也安全无毒 后期还需进一步通过一系列毒理学 试验来确保其安全性 比如急性经口 急性经皮毒 性试验 急性皮肤刺激试验等 单独接种 的处理组烟草和棉花幼苗的植株弱小 株高增长缓 慢或停滞 叶片发黄枯萎至死亡 茎基部维管束褐 化 而接种生防菌剂 及商业化 的生防菌剂 两组处理下烟草和 棉花的 长 势 良 好 和 空 白 对 照 组 基 本 一 致 说 明 对室内烟草和棉花黄萎病的发生具有 卷第 期 纪晓彬等 芽胞杆菌 对大丽轮枝菌抑制效果研究 良好的防效 且效果与商业化菌剂 相当 同时 经生防菌剂处理的烟草和棉花的根茎结合部 位组织 仅 能 检 测 到 少 量 的 大 丽 轮 枝 菌 对 接 种 的烟草根际生防菌的检测发 现 生 防 菌能够在根际有效定殖 并且不受后来入侵的病原 菌大丽轮枝菌制约 说明 菌株具有良好的 生防应用前景 参考文献 马存 简桂良 孙文姬 我国棉花品种抗黄萎病鉴定存在的问 题及对策 棉花学报 申建芳 东北 华北马铃薯黄萎病病原菌分离鉴定和遗传多样 性及生物防治的初步研究 呼 和 浩 特 内 蒙 古 农 业 大 学 李晓林 防治棉花黄萎病生防菌的筛选及其另一个新病原菌 的发现 杭州 浙江大学 赵卫松 李社增 鹿秀云 等 解淀粉芽孢杆菌 对 小麦的促生作用及产量影响 中国生物防治学报 李广华 李虎 戴爱海 亿活芽孢 克枯草芽孢杆菌可湿 性粉剂防治棉花黄萎病大田试验 新疆农业科技 朱统国 王曙文 李晓伟 等 向日葵黄萎病综合防控技术研 究 山东农业科学 许艳丽 张红骥 张匀华 等 复配生防菌株防治大豆根腐病 的研究 大豆科学 谭兆赞 林捷 刘可星 等 复合微生物菌剂对番茄青枯病和 土壤微生物多样性的影响 华南农业大学学报 李国 赵辉 刘元元 等 多元混菌培养对棉花黄萎菌拮抗效 果的研究 中国生物防治学报 中华人民共和国农业部 细菌微生物农 药枯草芽孢杆菌第一部分 枯草芽孢杆菌母药 北京 中国 标准出版社 中华人民共和国国家石油和化学工业局 农药可湿性粉剂润湿性测定方法 北京 中国标准出版社 中国石油和化学工业学会 农药悬浮率测 定方法 北京 中国标准出版社 中华人民共和国化学工业部 农药 值测 定方法 北京 中国标准出版社 中华人民共和国国家化学工业部 农药粉 剂 可湿性粉剂细度测定方法 北 京 中 国 标 准 出 版 社 刘振华 多粘类芽孢杆菌和海洋芽孢杆菌可湿性粉剂的研制 及其加工工艺的优化和放大 上海 华东理工大学 王剑 生防菌 发酵优化及其可湿性粉剂 微胶囊剂的创 制 上海 华东理工大学 责任编辑 田 喆