绿盲蝽雷帕霉素靶蛋白的克隆、抗体制备及在蜕皮激素诱导下的应答.pdf

中国农业科学 2021 54 10 2118 2131 Scientia Agricultura Sinica doi 10 3864 j issn 0578 1752 2021 10 008 收稿日期 2020 07 31 接受日期 2020 09 07 基金项目 国家重点研发计划 2017YFD0201900 国家现代农业产业技术体系建设专项资金 CARS 15 18 国家自然科学基金 31301668 转 基因棉花环境安全性评价技术 2016ZX08011 江苏省农业科学院院基金 611613 联系方式 谭永安 E mail kellytan001 通信作者肖留斌 E mail xlb 通信作者郝德君 E mail dejunhao 开放科学 资源服务 标识码 OSID 绿盲蝽雷帕霉素靶蛋白的克隆 抗体制备及在蜕皮 激素诱导下的应答 谭永安 1 赵旭东 2 姜义平 1 赵静 1 肖留斌 1 郝德君 2 1 江苏省农业科学院植物保护研究所 南京210014 2 南京林业大学南方现代林业协同创新中心 林学院 南京210037 摘要 目的 克隆绿盲蝽 Apolygus lucorum 雷帕霉素靶标全长基因 AlTOR 研究 AlTOR 时空表达特性及在外源蜕皮 激素 20E 诱导下的应答响应 进一步获得原核表达的重组蛋白及制备多克隆抗体 分析该抗体的特异性 为后续研究 AlTOR 蛋白功能打下基础 方法 RACE 法克隆 AlTOR 基因序列全长 qRT PCR 分析 AlTOR 表达特性以及在 20E 及其抑制剂 U73122 诱导下的应答响应 将含有 AlTOR 序列T载体经 EcoR I及 Xho I 双酶切 构建原核表达载体 pCzn1 AlTOR 经 20 0 5 mmol L 1 IPTG 诱导表达 变性 复性和蛋白纯化后 以获得 AlTOR 重组蛋白 最后再通过免疫 制备 AlTOR 蛋白多克隆抗体 Wester n blot 评价该抗体的特异性 结果 AlTOR 的开放阅读框编码包含 435 个氨基酸 具有典型的 TOR 基因序列特征 即 SIN1 结构域 高度保守的 CRIM 结构域及 PH 域 AlTOR 在绿盲蝽不同日龄 不同组织中均有表达 且在 1 日龄以及脂肪体中表达 量最高 20E 可诱导绿盲蝽不同日龄若虫期 AlTOR 的表达 同时也能诱导成虫头 翅 卵巢和脂肪体中 AlTOR 表达上调 分 别上调 200 00 118 89 20 53 和 60 82 而 U73122 在中肠和卵巢中会显著抑制 AlTOR 的表达 经双酶切的重组克隆载 体可成功亚克隆到 pCzn1 载体上 命名为 pCzn1 AlTOR IPTG 诱导的重组质粒可特异性表达一个约 36 kD 的蛋白 且主 要以 包涵体形式存在 经 Ni IDA 亲和层析纯化后 仅在 36 kD 附近有一条明显的特异性条带 进一步免疫及间接 ELISA 方法确 定抗血清对 TOR 蛋白的效价 Western blot 分析表明制备的多克隆抗体可以特异性与 AlTOR 重组蛋白及绿盲蝽 3 龄若虫总 蛋白结合 说明制备的 AlTOR 多克隆抗体特异性较好 可以用于后续的蛋白研究 结论 AlTOR 在绿盲蝽体内的表达谱显 示出发育阶段特异性和组织特异性 20E 及其抑制剂诱导后 AlTOR 呈现出相反的应答反应 本研究获得的 AlTOR 重组蛋白 的多克隆抗体具有高特异性 关键词 绿盲蝽 雷帕霉素靶标 基因克隆 蜕皮激素 多克隆抗体 表达 Cloning Preparation of Antibody and Response Induced by 20 Hydroxyecdysone of Target of Rapamycin in Apolygus lucorum TAN YongAn 1 ZHAO XuDong 2 JIANG YiPing 1 ZHAO Jing 1 XIAO LiuBin 1 HAO DeJun 2 1 Institute of Plant Protection Jiangsu Academy of Agricultural Sciences Nanjing 210014 2 Co Innovation Center for the Sustainable Forestry in Southern China College of Forestry Nanjing Forestry University Nanjing 210037 Abstract Objective The objective of this study is to clone the target of rapamycin gene TOR of Apolygus lucorum AlTOR analyze the expression profile of AlTOR as well as its expression patterns after injection of 20 hydroxyecdysone 20E and its inhibitor U73122 obtain the recombinant protein and antibody against AlTOR protein and to lay the foundation for the further study 10期 谭永安等 绿盲蝽雷帕霉素靶蛋白的克隆 抗体制备及在蜕皮激素诱导下的应答 2119 of AlTOR protein function Method The full length of AlTOR was cloned by RACE method Using qRT PCR technique the expression pattern of AlTOR was determined at different developmental stages and different tissues in A lucorum as well as its expression patterns after injection of 20E and U73122 To construct its prokaryotic expression pCzn1 AlTOR T vector containing the target gene was digested with the restriction enzyme EcoR I and Xho I and subcloned The recombinant plasmid containing target gene was specifically expressed after induction by IPTG The target recombinant protein has over expressed and has been purified by using Ni NTA agarose The polyclonal antibody was obtained by rabbit immunity cell fusion and ascites preparation and Western blot was used to detect the specificity of antibody Result The open reading frame of AlTOR encodes 435 amino acids AlTOR protein has the typical domains including the SIN1 domain highly conserved CRIM domain and PH domain qRT PCR results showed that AlTOR was expressed in 1 day old to 16 day old of A lucorum in which the expression level was the highest at 1 day old AlTOR was expressed in all tissues of A lucorum female adults and the fat body had the highest expression level 20E could induce the expression of AlTOR at different day old nymphs and could also induce the up regulated expression of AlTOR in the head wing ovary and fat body of the female adults which was increased by 200 00 118 89 20 53 and 60 82 respectively while U73122 significantly suppressed AlTOR expression in the midgut and ovary The vector containing AlTOR was digested and linked to the vector pCzn1 The recombinant plasmid pCzn1 AlTOR expressed the target recombinant protein of 36 kD after induction by IPTG The 36 kD target protein from the strain containing AlTOR was obtained by the Ni NTA agarose and used as the antigen and one cell line polyclonal antibody could specifically bind to the AlTOR recombinant protein and the total protein of the 3rd instar nymph of A lucorum indicating that the prepared AlTOR polyclonal antibody has good specificity Conclusion The expression of AlTOR shows the developmental stage and tissue specificity After the induction of 20E and its inhibitor AlTOR shows the opposite responses The obtained polyclonal antibody against AlTOR recombinant protein is highly specific Key words Apolygus lucorum target of rapamycin TOR gene cloning 20 hydroxyecdysone 20E polyclonal antibody expression 0 引言 研究意义 绿盲蝽 Apolygus lucorum 属半翅 目 Hemiptera 盲蝽科 Miridae 寄主范围广泛 可危害棉花等多种经济作物 1 2 20世纪90年代末以 来 由于Bt棉的大面积推广种植和农业产业结构的调 整 绿盲蝽种群数量急剧上升 已成为棉田主要害虫 并迅速波及枣树 葡萄 樱桃 桃等多种果树 严重 影响其产量及品质 生产上对化学农药的长期依赖势 必会导致绿盲蝽的抗药性日渐增强 从而造成防治效 果下降 3 4 因此 目前绿盲蝽防控面临严峻挑战 亟 需开拓基于新靶标的有效防控技术 前人研究进展 雷帕霉素靶蛋白 target of rapamycin TOR 是一种 丝氨酸 苏氨酸激酶 在细胞代谢 生长及增殖方面至 关重要 5 6 TOR可分为TOR复合物1 TOR complex 1 TORC1 和TOR复合物2 TOR complex 2 TORC2 TORC1是TOR与RapTOR regulatory associated protein of mTOR 及mLST8 mammalian lethal with Sec13 protein 8 形成的一个对雷帕霉素敏 感的复合物 可调控细胞内蛋白质翻译 细胞凋亡及 细胞周期等关键生理过程 7 8 TORC2是由RicTOR rapamycin insensitive cornpanion of mTOR Sinl 也称为Mip1 与mLST8 mTOR共同形成的对 雷帕霉素不敏感的复合物 通过调控蛋白激酶B protein kinase B PKB 和蛋白激酶C protein kinase C PKC 的活化 主要参与细胞极性 空间及骨 架结构的形成 9 在昆虫中 TOR可通过直接耦合 前胸腺中的营养感应 从而在蜕皮激素 20E 生 成及蜕皮过程中发挥重要作用 10 11 研究表明 抑 制TOR的表达可造成幼虫发育历期延长 同时与 蜕皮激素合成相关基因的表达量下调 表明昆虫在 生长发育以及蜕皮变态时需要TOR的参与 此外 在 幼虫营养缺乏的条件下 TOR信号的激活会诱导蜕 皮激素的生成 使幼虫完成正常蜕皮及变态行为 12 TOR信号也可受蜕皮激素的调控 13 14 对黑腹果蝇 Drosophila melanogaster 的研究发现 当幼虫摄 入营养时 蜕皮激素抑制TOR信号介导调控胰岛素 样肽 ILP 生成胰岛素分泌细胞来调控果蝇的生长 发育 15 16 本研究切入点 目前对于TOR的研究多 集中在植物 哺乳动物及一些模式昆虫上 17 19 对绿 盲蝽AlTOR的相关研究尚未见报道 拟解决的关键 问题 采用RACE技术从绿盲蝽中扩增AlTOR全长 运用生物信息学方法对该基因进行结构分析和同源进 化分析 并利用qRT PCR阐明其时空表达动态及20E 对其表达的影响 同时将其在原核细胞中进行高效表 达 筛选最佳表达条件 以获得纯化蛋白 最后制备 2120 中 国 农 业 科 学 54卷 特异性的抗体 为在蛋白水平进一步研究该基因的功 能打下基础 1 材料与方法 试验于2018年9月至2019年12月在江苏省农业 科学院植物保护研究所完成 1 1 供试昆虫 绿盲蝽于2018年采自江苏沿海棉区的大丰市蚕 豆田 33 11 N 120 25 E 室内用新鲜四季豆 Phaseolus vulgaris 续代饲养 饲养条件为温度 27 0 5 相对湿度 70 5 光周期14L 10D 1 2 主要试剂及仪器 RNA提取试剂盒 Promega M MLV反转录 试剂盒 Promega BD SMART TM RACE cDNA Amplification Kit 宝生物工程 大连 有限公司 pCzn1表达载体 PFU DNA聚合酶 南京钟鼎生物技 术有限公司 TOP10菌株 天根生化科技有限公司 大肠杆菌 Escherichia coli Arctic Express DE3 Agilent 卡那霉素 咪唑 尿素 上海生工生物 工程有限公司 限制性内切酶 TaKaRa Protein Marker Thermo IPTG Acr Bis Tris Sigma SDS Amresco TEMED BIO RAD 高糖 Tyrptone Yeast Extract OXOID Agarose 上海赛百盛基因 技术有限公司 其他试剂均为国产分析纯 Ni 2 IDA 亲和层析胶 Novagen HexIOS分光光度计 Allegra 21R台式高速冷冻离心机 Beckman 台式高速离 心机 Sorval Biologic LP层析系统 Mini Protean II 垂直平板电泳系统 水平电泳系统 BIO RAD PTC 200基因扩增仪 MJ Research 20E U73211 Sigma 1 3 AlTOR 全长基因的克隆 基于实验室构建的绿盲蝽转录组数据及已报道昆 虫TOR进行BLAST搜索 筛选绿盲蝽转录组中可能 的TOR基因片段序列 从而进行克隆验证 根据获得 的序列设计特异性引物 表1 进行AlTOR 5 和3 端序列的克隆 取绿盲蝽3龄若虫20头 Trizol法提 取总RNA后合成cDNA第1链 根据设计的特异性 上游引物和下游引物 进行AlTOR 5 和3 端序列的克 隆 5 端序列的克隆采用巢式PCR 第一轮反应体系 10 PCR缓冲液5 0 L 25 mmol L 1 MgCl 2 3 0 L 10 mmol L 1 dNTP Mix 1 0 L 10 mol L 1 5 AlTOR 1 2 0 L 10 mol L 1 通用引物Abridged Anchor Primer 2 0 L cDNA 5 0 L Taq DNA聚合酶0 5 U 超纯 水补足至50 0 L 第二轮反应体系 10 PCR缓冲 液5 0 L 25 mmol L 1 MgCl 2 3 0 L 10 mmol L 1 dNTP Mix 1 0 L 10 mol L 1 5 AlTOR 2 1 0 L 10 mol L 1 通用引物Abridged Universal Amplification Primer 1 0 L 第一轮PCR产物5 0 L Taq DNA 聚合酶0 5 U 超纯水补足至50 0 L PCR反应条件 预变性94 2 min 94 30 s 55 30 s 72 1 min 循环35次 72 延伸7 min 3 端序列的克隆 也采用巢式PCR 第一轮反应体系 PCR Grade Water 34 5 L 10 Advantage 2 PCR Buffer 5 0 L 10 mmol L 1 dNTP Mix 1 0 L 50 Advantage 2 Polymerase Mix 1 0 L cDNA 2 5 L 10 mol L 1 3 AlTOR 1 1 0 L 10 UPM 5 0 L 超纯水补足至 50 0 L 第二轮反应体系 PCR Grade Water 34 5 L 10 Advantage 2 PCR Buffer 5 0 L 10 mmol L 1 dNTP Mix 1 0 L 50 Advantage 2 Polymerase Mix 1 0 L 第一轮PCR产物2 5 L 10 mol L 1 3 AlTOR 2 1 0 L 10 UPM 5 0 L 超纯水补足至 50 0 L PCR反应条件 预变性94 2 min 94 30 s 68 30 s 72 1 min 循环30次 72 延伸7 min 将获得的5 和3 端及保守区域进行拼接和测序 上海生工生物工程有限公司 最终获得AlTOR 全长 最后根据测序结果 设计全长基因克隆引物 AlTOR F和AlTOR R 进行AlTOR全长基因的 克隆 表 1 本研究所用的引物 Table 1 Primer sequences used in this study 引物名称 目的 Primer name Purpose 序列 Primer sequence 5 to 3 克隆Cloning 5 AlTOR 1 AACGACTGGGCAAGAA 5 AlTOR 2 CAAGACGTTTGGGTAGCA 3 AlTOR 1 AGAGACTCAGTCGCTCACTATCAAGA 3 AlTOR 2 CATTGAGACCACACCCCAGACACA AlTOR F ATGGTGGAAAAATATGCTCG AlTOR R GCTAGCCAGTATACAACG 表达谱分析qRT PCR RT AlTOR F GGGGTCGTCAACTGGCAGAA RT AlTOR R CCTCCTTCTTCTTGGGTGCGA Al Actin F ACCTGTACGCCAACACCGT Al Actin R TGGAGAGAGAGGCGAGGAT 10期 谭永安等 绿盲蝽雷帕霉素靶蛋白的克隆 抗体制备及在蜕皮激素诱导下的应答 2121 1 4 AlTOR 时空表达定量检测 收集绿盲蝽不同日龄若虫及羽化7 d后雌成虫的 不同组织 头 胸 翅 足 中肠 卵巢和脂肪体 其中不同日龄样本每个处理15头 不同组织样本每个 处理10头雌成虫 并设计3个生物学重复 每个生物 学重复设置3个技术重复 液氮处理样品后 80 冰箱 保存备用 Trizol法提取总RNA Prime Script TM RT Master Mix反转录合成cDNA 20 保存 qRT PCR 试验步骤按照SYBR Premix Ex Taq Kit说明书上进 行 所用的AlTOR引物参见表1 并以绿盲蝽持家基 因 actin为内标对照基因 20 GenBank登录号 JN616391 扩增体系 UltraSYBR Mix 12 5 L 上 下游引物各0 5 L cDNA模板2 L ddH 2 O 9 5 L 扩增条件 95 预变性5 min 然后95 10 s 60 20 s 72 20 s 循环40次 1 5 20E 处理绿盲蝽若虫 分别用20E 2 mol L 1 U73122 20E抑制剂 21 50 mol L 1 20E U73122处理 乙醇 CK 浸泡 切除两端的四季豆1 min 晾干后饲喂初孵1龄若虫 每处理绿盲蝽400头 重复4次 按1 4方法收集绿 盲蝽不同发育阶段和不同组织样本后 分析不同处理 AlTOR表达量 1 6 AlTOR 序列分析与进化树分析 AlTOR核苷酸序列分析使用Expasy在线程序 http web expasy org compute pi 进行预测分析 蛋白结构域分析运用SMART在线分析 http smart embl heidelberg de 氨基酸序列比对软件使用 ClustalX进行 利用MEGA 6 0软件包中的邻接法 neighbor joining NJ 构建进化树 并1 000次重 复构建 1 7 AlTOR 在大肠杆菌中的表达 使用DNASTAR Protean软件分析AlTOR蛋白 Antigenic index 选取抗原性较好的区域 72 381 蛋白质理论分子量为35 83 kD 作为免疫原区域 使 用原核表达获得抗原蛋白 基于PAS PCR based accurate synthesis 的方法 在引物的两端各设计保护 性碱基合成基因6731 2S 将其连入pCzn1重组质粒 用限制性内切酶EcoR I及Xho I双酶切后进行连接 酶切体系 两种限制性内切酶各0 25 L 10 Buffer 缓冲液1 0 L 带有合适酶切位点的基因片段3 L 用ddH 2 O补足至10 L 37 水浴3 h 连接体系 酶 切回收后的载体5 0 L 基因片段10 0 L T4 DNA 连接酶1 0 L 10 Buffer缓冲液2 0 L 用ddH 2 O 补足至20 L 16 反应12 16 h 连接产物转化大肠杆菌TOP10后采用PCR筛选 阳性克隆 将鉴定正确的重组质粒pCzn1 AlTOR转化 到大肠杆菌Arctic Express感受态细胞 具体方法 将 质粒1 L加入100 L感受态细菌中 置冰上20 min 42 热激90 s 迅速置冰中5 min 加入600 L LB培 养液 37 220 r min振摇1 h 离心后全部涂布于 含50 g mL 1 Amp的LB平板 37 倒置培养过夜 挑取转化平板上的多克隆接种于含50 g mL 1 Amp的 3 mL LB培养液的试管中 37 220 r min振摇过夜 次日按1 100接种于50 g mL 1 Amp的30 mL LB培 养液中 37 220 r min 振摇至菌体OD 600 为0 6 0 8 取出1 mL培养物 10 000 r min室温离心2 min 弃上清 用100 L 1 上样缓冲液重悬菌体沉淀 向 剩余的培养物中加入IPTG至终浓度为0 5 mmol L 1 20 220 r min振摇过夜 诱导融合蛋白表达 取出1 mL培养物 10 000 r min室温离心2 min 弃上清 用100 L 1 上样缓冲液重悬菌体沉淀 剩余培养物 4 000 r min 离心10 min 弃上清 用PBS重悬菌体 沉淀 重悬液进行超声波破碎后 分别取上清液与沉 淀液加入上样缓冲液重悬 12 SDS PAGE检测分析 考马斯亮蓝染色显带 1 8 包涵体蛋白的变性和复性 先将菌体沉淀重悬于20 mL裂解液 20 mmol L 1 Tris HCl containing 1 mmol L 1 PMSF pH 8 0 中 超 声破碎 功率400 W 工作4 s 间歇8 s 共20 min 收集沉淀 使用包涵体洗涤液 20 mmol L 1 Tris 1 mmol L 1 EDTA 2 mol L 1 尿素 1 mol L 1 NaCl 1 Triton X 100 pH 8 0 洗涤包涵体3次 再使用溶解 缓冲液 20 mmol L 1 Tris 5 mmol L 1 DTT 8 mol L 1 尿素 pH 8 0 溶解包涵体 4 过夜 室温 10 000 r min离心15 min 将上述溶液滴加缓冲液 20 mmol L 1 Tris HCl 0 15 mol L 1 NaCl pH 8 0 逐 步成倍梯度稀释缓慢搅拌 将蛋白溶液装入透析袋于 上述缓冲液中透析过夜 1 9 融合蛋白的 Ni 柱亲和纯化 利用低压层析系统 包涵体溶液以0 5 mL min 1 流速上样至Ni IDA Binding Buffer预平衡的Ni IDA Sepharose CL 6B亲和层析柱 Ni IDA Binding Buffer 以0 5 mL min 1 流速冲洗 至流出液OD 280 值到达基 线 再用Ni IDA Washing Buffer 20 mmol L 1 Tris HCl 20 mmol L 1 咪唑 0 15 mol L 1 NaCl pH 8 0 以1 mL min 1 流速冲洗 至流出液OD 280 值到达基线 2122 中 国 农 业 科 学 54卷 用Ni IDA Elution Buffer 20 mmol L 1 Tris HCl 250 mmol L 1 咪唑 0 15 mol L 1 NaCl pH 8 0 以1 mL min 1 流速洗脱目的蛋白 收集流出液 上述收集的蛋白溶 液加入透析袋中 使用Ni IDA Elution Buffer进行透 析过夜 12 SDS PAGE分析后利用BSA蛋白定量 试剂盒测定蛋白浓度 1 10 AlTOR 多克隆抗体的制备 取纯化的AlTOR重组蛋白免疫新西兰白兔 江 苏省农业科学院兽医研究所提供 皮下注射 每次 免疫量为400 g 2 3周免疫一次 共免疫4次 第 4次免疫后在大白兔颈动脉采血 8 000 r min离心8 min所得上清制备抗血清并准备纯化抗体 TOR蛋白 与琼脂糖介质偶联制备成抗原亲和纯化层析柱 将 PBS与所得抗血清等量混合后缓慢上样 待抗体抗原 结合后用甘氨酸洗脱缓冲液洗脱得到所需纯化抗体 并在PBS缓冲液 pH 7 4 中进行透析过夜 4 隔日进行效价测定 BCA浓度测定试剂盒对所得抗体 进行浓度测定 1 11 效价测定 间接ELISA法对抗体进行效价测定 以纯化的 AlTOR重组蛋白 5 g mL 1 包被ELISA板 每孔加 入100 mL 4 过夜 用PBST 0 2 g KCl 0 2 g KH 2 PO 4 2 9 g NaHPO 4 12H 2 O 8 g NaC1 0 05 Tween 20 pH 7 4 洗涤3次 加入PBST封闭液 含 5 牛血清白蛋白 于37 封闭2 h 取出酶标板 弃 去内液 用PBST洗板3次 加入用PBST连续倍比 稀释的AlTOR多克隆抗体和阴性血清每孔100 L 37 恒温箱1 h 同上洗涤后 加入100 L的用PBST 以1 5 000稀释的二抗HRP IgG 37 放置1 h 用 PBST洗板3次 每次5 min 最后加100 L TMB底 物液显色 37 显色15 min 待终止反应后 酶标仪 测定A 450 值 1 12 AlTOR 多克隆抗体的鉴定 检测多克隆抗体的特异性Western blot测定按照 SONG等 22 的方法进行并稍作修改 将原核表达的 AlTOR重组蛋白及3龄绿盲蝽若虫总蛋白进行 SDS PAGE分析 转印PVDF膜后封闭 一抗为上述 制备的蛋白抗体 二抗为辣根过氧化物酶标记的兔抗 鼠HRP 1 13 数据分析 不同处理的AlTOR相对表达量变化以2 Ct 23 计 算 差异显著性采用统计软件SAS 8 0中的Duncan 氏新复极差法进行分析 2 结果 2 1 AlTOR 的克隆及序列分析 利用绿盲蝽转录组筛选AlTOR基因序列 再利 用RACE方法 分别进行5 和3 末端的扩增 获得 了AlTOR的全长序列 图1 序列分析结果表明 AlTOR全长1 652 bp 包括一个208 bp的5 非翻译区 以及136 bp的3 端非翻译区 AlTOR开放阅读框含有 1 308 bp的核苷酸 编码435个氨基酸 理论等电点 预测为7 16 结构域分析表明 AlTOR基因翻译后的 氨基酸序列具有典型的TOR特征 含有N 末端的 SIN1结构域 288 bp 高度保守的CRIM结构域 390 bp 及脂质与膜结合相关C 末端的PH域 363 bp 图2 2 2 多重联比及进化树分析 多重联比结果如图3所示 TOR在半翅目昆虫中 较为保守 尤其是CRIM结构域 AlTOR的氨基酸序 列与半翅目臭虫科温带臭虫 Cimex lectularius 以及 蝽科茶翅蝽 Halyomorpha halys 的TOR氨基酸序列 一致性相对较高 分别为55 78 和54 38 与其他 昆虫的TOR基因序列一致性较低 如膜翅目的造纸胡 蜂 Polistes dominula 38 70 及芜菁叶蜂 Athalia rosae 39 33 AB C 2000 bp 1500 1000 750 500 300 150 50 MM M M321 A 5 端5 end B 3 端3 end C 全长Full sequence M DL2000 1 5 端第二轮PCR产物The second round of 5 PCR product 2 3 端第 二轮PCR产物The second round of 3 PCR product 3 全长PCR产物 Full sequence of PCR product 图 1 AlTOR 的5 3 端及全长序列 PCR 产物 Fig 1 PCR products of 5 3 end and full sequences from AlTOR 10期 谭永安等 绿盲蝽雷帕霉素靶蛋白的克隆 抗体制备及在蜕皮激素诱导下的应答 2123 1 ATG TGT GAG GTG GTG ATG ACG TGT GAC AAT GTT GCA CGT CAA ATA CCA GTG GGA AAA TAT M C E V V M T C D N V A R Q I P V G K Y 21 GAC TGC TAC CCA AAC GTC TTG GAG GAG GAG GAG GAA GAT GCC ATT CTT GCC CAG TCG TTT D C Y P N V L E E E E E D A I L A Q S F 41 GAC ATC AAT TCG GAT TTG CAA TTC GGT CTC AGG AGA CCG AAA GCG CGG ATG GAG AGG GCG D I N S D L Q F G L R R P K A R M E R A 61 GTC AGC ACG GAG AAA AAG AAA GCG ATC AAG TCG AAA AAC ATC AAG TGG ACC AAC CCT TCC V S T E K K K A I K S K N I K W T N P S 81 CGT CTT CTA TCC AAT GAC GAA CTG AAC GTG TTC TTC CCG CAT AAG GAC CTT GAA CTA ACC R L L S N D E L N V F F P H K D L E L T 101 AGG AAG GAG AAC GCC GGA AAA AGG GTG TCA CTC CTC ACT GAG CTC CTC GCC AAG TAT CCA R K E N A G K R V S L L T E L L A K Y P 121 AAT CAG CCC GAT AAC CCT TTC AAA GAC TAT GCC AAA CTC GAT GGC AAT GCG CAG GTT GGT N Q P D N P F K D Y A K L D G N A Q V G 141 GTT CCT ATT AAA AAA TAT AGA ATT TAC GTT ACT ATG CTG CCA GAG GAA ATT CAG AAG TTC V P I K K Y R I Y V T M L P E E I Q K F 161 CCC ATG GAA GTT ACG ATT GTA GCG TCA GCG AAA GTC AGT GAT CTA ATC GGT CTC ATT TGT P M E V T I V A S A K V S D L I G L I C 181 TGG AAA TGT TCA ACC GAG TTC ACG GAT GTC TCT TTA AAG GAC AGC GCG AGT AAC TAT AGT W K C S T E F T D V S L K D S A S N Y S 201 CTG TAC ATA GCT GAA GAT GAT GGT GAC GTT GAC TGG GAC TTT CCT TGT CTC GAC TCC CGG L Y I A E D D G D V D W D F P C L D S R 221 GAA ATT ATT AAC AAG TTT GGT TTT TCC TAC CTC GCA ATC GTT GAT AGA GAC TCA GTC GCT E I I N K F G F S Y L A I V D R D S V A 241 CAC TAT CAA GAT GAA TCA TAT CCT CTA GTC ATT GAG ACC ACA CCC CAG ACA CAC GAG CCA H Y Q D E S Y P L V I E T T P Q T H E P 261 CCA TCA TCA ATT AGA GAC CGA GTA CAG AGG AAC TGG GAC GCG AGG ATT ATG AGG GGA CAA P S S I R D R V Q R N W D A R I M R G Q 281 ATG GAC GCC CTG GAG GCA CCT TTG TTC CAG TCG TTT TGT GTC TTT TTA CTA AAC AGG ATC M D A L E A P L F Q S F C V F L L N R I 301 CGC GTC AGG ACT GAA GTA TAC CTA GAA ATT TC