一株兼具降解纤维素和抗草莓重茬病害能力细菌的筛选和应用.pdf

果 树 资 源學報 一 株 兼 具 降 解 纤 维 素 和 抗 草 莓 重 茬 病 害 能 力 细 菌 的 筛 选 和 应 用 肖 蓉 邓 舒 山西农业大学果树研究所 山西太原 收 稿 日 期 第 一 作 者 简 介 肖 蓉 女 硕士研究生 副研究员 主要从事园艺植物重茬障碍生物防治的研究 摘 要 从腐熟牛粪中筛选兼具降解纤维素功能和抗草莓重茬病害功能的细菌 为草莓夏季高温闷 棚时提供菌种资源 结果 筛选出 株有纤维素降解功能的细菌 水解圈直径达 对草 莓灰霉菌 镰刀菌和拟盘多毛孢菌表现出强烈拮抗作用 离体叶片实验中 对草莓灰霉病的防效达 盆栽试验也验证了 对草莓灰霉病有较高的防效 经形态特征 生理生化特征和 测 序 被鉴定为解淀粉芽孢杆菌 关 键 词 纤维素降解 重茬病害 草莓 生物防治 文 章 编 号 中 图 分 类 号 文 献 标 识 码 I s o l a t i onandA pp l i c a t i ono fBa c t e r i umwi t h Re s i s t i n g S t r awb e r r y Re p l an tDi s e a s e sandCe l l u l o s eDe g r ad i n g Ab s t r a c t o t ry t i s i n e r e a u s ar i umsp e s t a l o t i ops i ssp o t ry t i s i n e r e a a c i l l u s my l o l i qu efa c i e n s Ke ywo r d s 在生产上 为了保证优质高产 设施栽培草莓每 年都换新苗 重茬问题在所难免 重茬病害严重成为 草莓设施栽培中的一大难题 近几年 随着高温闷 棚技术的普及 多数果农均会在 月对草莓大棚 进行高温闷棚杀菌 以减轻土壤中病原菌基数 研究指出 闷棚时将秸秆 蘑菇菌渣 牛粪等有机物 一起施入土壤 既可以提高地温 又可以增加土壤肥 力 杀菌 杀虫与施肥同步进行 一举多得 但 是由于各地每年的气温条件都不一样 如果在闷棚 期间遇到连日阴天 则施加的秸秆 蘑菇菌渣等有机 物不能充分腐熟 就会影响新栽的草莓苗生长 因 此 为了保证有机物的充分腐熟以及病原菌的消杀 人们在高温闷棚时需分别添加具有纤维素降解功能 和病害拮抗功能的生物菌剂 本试验研究旨在筛 选一种兼具纤维素降解功能和草莓病害拮抗功能的 细菌 以使生产中进行高温闷棚时更便捷高效 材料与方法 细 菌 的 筛 选 初筛 以能够产生纤维素降解酶为初筛指标 以腐熟牛粪为原材料 将 牛粪放入 无菌 水中 充分震荡混匀 然后梯度稀释到 浓度 取 浓度的稀释液 涂布在羧 甲基纤维素钠固体培养基上 黑暗条件倒置培 养 羧甲基纤维素钠培养基配方为 羧甲基纤维素 钠 酵母粉 磷酸二氢钾 硝酸铵 硫酸镁 待单菌落长出后 挑取单 菌落接种于新的羧甲基纤维素钠固体平板 恒温培养 刚果红染色 筛选出透明圈较大的 菌落 编号 转移到新的平板上 多次划线培养纯化 后接于羧甲基纤维素钠固体斜面上 保存用于 后续试验 复筛 采用平板对峙培养方法 以本实验室保存 的常见草莓病原菌灰霉菌 镰刀菌和拟盘多毛孢菌 为靶标菌进行复筛 取病原菌菌丝接种于 固 体培养基平板中央 按等边三角形 个顶点的方向 将初筛细菌接种于病害菌周围 于 条件下黑暗 倒置培养 以只接种病害菌 不接种细菌的平板作 为对照 以后观察病害菌生长状况 细 菌 鉴 定 参考 常见细菌系统鉴定手册 方法进行生理 生化鉴定 分子鉴定 挑取细菌单菌落接于 液体培养基 中 摇床培养过夜 取 菌液 离心 弃上清 于沉淀中加入 灭菌超纯 水 充分混匀后 置于 水浴 裂解 裂解 液作为模板进行 反应 引物为通用引物 和 由生工生物工程 上海 股份有限公 司合成 引物序列为 和 体系为 上下游引物各 模板 酶 加水补齐至 程序 为 个循环 产物经 琼脂糖 凝胶电泳检测后送往北京华大生物工程技术有限公 司测序 测序结果经 网页 比对获知菌 株的分子鉴定结果 菌 株 对 草 莓 灰 霉 病 的 防 治 草 莓 活 体 组 织 测 试 采用叶片法测定细菌发酵原液对草莓灰霉病的 防效 将生长健康 大小一致的草莓叶片从叶柄处 剪断 用自来水将叶片表面冲洗干净 再用 乙 醇进行表面消毒 用灭菌水冲洗干净后 在 发 酵液中浸渍 晾干 叶面朝上放于铺有无菌滤 纸保湿的培养皿内 叶柄用浸湿的灭菌棉球包裹 采取牙签划伤接种的方式将灰霉菌菌丝接种到叶片 上 以无菌水代替发酵液做对照 每组叶片共有 片 实验 以后进行病害调查 根据每片叶 子的变褐情况以目测法对病情进行记载 草莓叶部病害病级按 级划分 级 无病 级 发病面积占叶表面积 以下 级 发病面积占叶表面积 级 发病面积占叶表面积 级 发病面积占叶表面积 以上 病情指数 每一级的级值 该级的叶片数 总叶片数 最大级值 草 莓 盆 栽 测 试 采用盆栽灌根法进行 取处于苗期的生长健壮 无病草莓苗为试材 将细菌接种于羧甲基纤维素钠 培养基中 培养 后作为供试发酵原液 将 草莓灰霉病菌接种于 液体培养基中 摇 床培养 后备用 实验组和对照组各设置 次重 复 每盆种植一株健康 且长势一致的草莓苗 实验 组中 在草莓苗根部开沟 将培养好的细菌发酵液倒 入沟内 待菌液被土壤全部吸收 后 倒入灰霉 菌菌悬液 再覆盖沟槽 对照组中 以无菌水替代细 菌发酵液 其余步骤相同 用保鲜膜覆盖土壤以利 于保湿 其余浇水等按常规管理方式管理 结果与分析 菌 株 筛 选 从腐熟牛粪中分离出 株有纤维素降解功能 的细菌 经复筛获得 株透明圈较大的菌株 培养 时菌落直径 为 水解圈直径 为 值达 编号为 如图 所示 图 刚 果 红 染 色 图 菌 株 对 病 原 菌 的 平 板 拮 抗 效 果 从图 中可以明显看出 与对照相比 当在培养 基上同时接种 时 草莓灰霉菌 镰刀菌和拟盘 多毛孢菌生长明显受到抑制 说明 对这 种常 见草莓病原菌有强烈的拮抗作用 菌 株 鉴 定 菌 株 形 态 及 生 理 特 征 果 树 资 源學報 图 与 草 莓 病 害 的 平 板 拮 抗 效 果 注 分别为灰霉菌 镰刀菌和拟盘多毛孢菌 在羧甲基纤维素钠固体平板上的培养特征 为 菌落边缘不整齐 呈放射状 直径 浅黄 色 不透明 表面湿润 图 采用简单染色和革兰 氏染色观察 细胞形态 发现该菌革兰氏染色呈 阳性 杆状 单个 成对或成串出现 有芽孢 芽孢囊 不膨大 芽孢椭圆形 中生 图 的部分生理 生化特征见表 图 菌 株 形 态 特 征 表 菌 株 的 生 理 生 化 指 标 指标 结果 指标 结果 革兰氏染色 水解淀粉实验 接触酶实验 甲基红实验 葡萄糖实验 明胶液化实验 阿拉伯糖实验 产硫化氢实验 甘露醇实验 柠檬酸实验 注 阳性 阴性 图 菌 株 显 微 形 态 图 菌 株 的 分 子 鉴 定 菌株 的序列长度为 使用 的 工具对 菌株的 序列进行 同源性比对 结果显示 与解淀粉芽孢杆菌 的 相似度达 根据对菌株的形态学 培养特征 生理生化和分 子鉴定的研究结果 菌株 鉴定为解淀粉芽孢杆 菌 解淀粉芽孢杆菌 在中国微生物菌种保藏 管理委员会普通微生物中心保藏 保藏登记号为 对 草 莓 灰 霉 病 的 防 治 选择灰霉菌作为靶标菌进一步验证 的实 际应用效果 离体草莓叶片接种实验结果见图 可见 只接种灰霉菌的对照组 几乎全部染病 叶片 出现茶褐色病斑 病斑逐渐扩大 后 有的整片 叶子均变为茶褐色 且表面覆盖一层灰褐色菌丝 病 情指数达 实验组叶片先经 处理后再 接种 后 仅有少量叶片出现茶褐色病斑 病情指数仅为 说明 对草莓灰霉病具有 较高的防效 图 对 灰 霉 病 的 防 效 为了检验 在实际土壤环境下对 病的 防效 我们设置了盆栽试验 将处理后的草莓苗在 条件下培养 以后 发现不加 发酵液 的对照组叶片有褐色斑点 叶缘发黄褐化 甚至整片 肖 蓉等 一株兼具降解纤维素和抗草莓重茬病害能力细菌的筛选和应用 叶子干枯 而用 发酵液处理过的试验组叶片 不见斑点和黄化 表现正常 图 说明在盆栽条 件下 发酵液也表现出对灰霉病的防治作用 图 防 治 灰 霉 病 的 盆 栽 实 验 讨论与结论 镰刀菌属真菌 u s ar i um 在世界范围内分 布广泛 它可危害多种植物 破坏植物的维管束系 统 引起植物萎蔫死亡和器官腐烂 是生产上防治最 艰难的土传病害之一 在草莓上可引起枯萎病 使草莓根部维管束变褐 叶片卷缩 萎蔫直至全株死 亡 拟盘多毛孢属 e s t a l o t i ops i s 是著名的植 物病原体品种 在草莓上能引起叶斑病 主要危害 叶片 起初产生红褐色病斑 后中央变为浅褐色 产 生轮纹 边缘出现明显的暗褐色坏死带 严重时叶片 枯死 灰霉病在草莓生长期 花期 果期均有可能发 生 病原菌为灰葡萄孢霉 o t ry t i s i ne r ea 其菌 丝 菌核及分生孢子可以在土壤或病残体上越冬或 越夏 是草莓最严重的土传病害之一 本研究中 分离出的 菌株对上述 种病原菌均表现出强 烈拮抗作用 因此 可以在下一步考虑将 作为 草莓专用生防菌剂 因其还兼具纤维素降解功能 故在高温闷棚时 只施加 一种菌剂 就可以同 时满足腐熟有机物及消杀病原菌功能 但还需在下 一步试验中优化 的产酶条件 以提高纤维素降 解功能 总之 本试验从腐熟牛粪中分离出 株有纤维 素降解功能的细菌 水解圈直径达 在平 板上 对草莓灰霉菌 镰刀菌和拟盘多毛孢菌表 现出强烈拮抗作用 离体叶片实验中 草莓灰霉病病 情指数达 试验组叶片病情指数仅为 对草莓灰霉病的防效达 盆栽试验也验证 了 对草莓灰霉病有较高的防效 经形态特征 生理生化特征和 测序 被鉴定为解 淀粉芽孢杆菌 参 考 文 献 邓亚利 设施草莓病虫害绿色防控技术 西北园艺 综 合 董海龙 路 平 张作刚 等 秸秆 石灰氮 菌肥 高温闷棚处理对根结线虫种群数量变化的影响 中 国农业大学学报 杨海燕 王周平 妙晓莉 高温闷棚改良技术在蔬菜日光 温室中的应用 中国瓜菜 陈 瑶 设施蔬菜高温闷棚与秸秆还田技术 四川农 业科技 何志刚 娄春荣 董 环 等 秸秆还田与高温闷棚对设施 连作土壤微生境及番茄生长发育的影响 河南农业科 学 周桂丽 棚室草莓解决重茬障碍的有效途径 中国果 菜 东秀珠 蔡妙英 常见细菌系统鉴定手册 北京 科学 出版社 雷恒树 华战迎 范灵姣 等 北京地区草莓枯萎病病原的 鉴定与防治 中国农业大学学报 赵景楠 马 喆 刘正坪 等 草莓拟盘多毛孢叶斑病的病 原菌 菌物学报 杨恩到 汪德志 陈丛良 等 大棚草霉灰霉病发生规律 及绿色防控技术 湖北植保 果 树 资 源學報